binbintt

欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

  那真的对不起大家了哦，我明天早上就补上！关于楼上兄弟提出的问题，还需要再提供详细点的资料才行！现在常用主要是染料法（SYBR Green I）和探针法（Taqman）。 水解探针或Taqman探针：这种探针用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’-3’活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从

triciavive

欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

^_^ 谢谢 两类方法的原理我都了解过了 现在要进行实验 做的是一段基因在酵母表达载体中转录水平的表达情况 计划是用染料法做相对定量 那引物要什么软件设计、管家基因怎么去选择呢？

binbintt

欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

  也就是说你是研究其mRNA表达水平，你可以从你的目的片段宿主中寻找那种恒定表达的基因来做为你的管家基因。比如你是从猪上扩增一个基因来表达， 那么你就可以选用猪的B-actin基因来作为你的管家基因。      至于引物的设计，你可以参照论坛内的一些关于引物设计的帖子都有相关介绍的，一般可以利用Primer或者oligo等都行。不过要记住如果你是使用探针法，那么探针的设计以及你引物的扩增片段设计都有一定的要求：一般探针要在你设计的引物扩增片段内，一般25个碱基左右，而扩增片段长度控制在90-150个碱

triciavive

欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

因为听说有专业的设计软件由内参基因的序列来设计内参引物，所以不知是怎样的专业设计软件。 而且，SYBR GreenⅠ作荧光染料做real time PCR所用的引物是不是就使用常规PCR引物设计软件进行设计？

binbintt

欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

    SYBR GreenI嵌合荧光法是利用SYBR GreenI这种嵌合染料，在游离状态几乎不发光，但嵌合在双链DNA中却能发出荧光，荧光信号的强度与双链DNA的分子数成同步增长的关系。但是这种嵌合作用并非特异的，即SYBR GreenI同时会嵌合到特异性PCR产物、非异性PCR产物、引物二聚体中，所以非异性PCR产物、引物二聚体的产生势必会影响对目的基因的准确定量，这是SYBR GreenI嵌合荧光法，最最应该注意的问题，即特异性问题。    所以引物设计是一般的软件就可以完成但是需要考虑的因素有点多，因

pilipingping

欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

好像还是没有那个第一个的第2部分，最近也要做实验，要用到设计引物，不是很明白荧光和设计引物的区别和方法，找到此帖受益非浅，还是希望版主有时间吧第2部分整理一下

boysil

欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

谢谢楼主的分享！！

poplu

欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

太感谢楼主了,简直是救命啊

困惑mxy

欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

谢谢楼主的分享！

hgh99618

欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

非常感谢！！