[蛋白质纯化与鉴定] 蛋白质纯化过程中出现两个峰 蛋白质, 纯化

mickel

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最近在做EGF的纯化工作 用的离子交换柱和凝胶柱 但是在过凝胶柱的时候，有时候会出现两个峰 但是通过SDS-PAGE，免疫印迹等试验 均说明两个峰没啥区别，都有反应的 不知道怎么回事？ 希望能在这里得到帮助 谢谢

hexinliu

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是同一种蛋白的不同空间构象吧

mickel

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回复 2# hexinliu 首先，非常感谢您的回答 那请问一下，该如何证明这个结论呢？还有前峰的纯度比中峰小2到3个百分点，该从哪方面去解决这个问题呢？

tangboyun

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普通的SDS-PAGE 是几条带？如果多条带，可能C或N端截短，或部分降解。如果SDS无区别，做非还原性SDS-PAGE，可能是不同的二硫键组合。自己配个loadingbuffer，不要加巯基乙醇。

mickel

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本帖最后由 mickel 于 10-3-19 08:47 编辑 回复 4# tangboyun 普通的SDS就只能看到一条带，我做了非还原性电泳了，结果也是一样，只有一条带，没什么大的区别 因为是两批合在一起做的层析 所以层析前样品在在做前一步疏水层析前放置了一夜以等第二批 请问，这个对离子交换会不会有什么影响呢

tangboyun

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本帖最后由 tangboyun 于 10-3-19 14:16 编辑 那可能的情况有： 1、你的蛋白部分变性。所以那些部分变性的，跑凝胶柱的速度有变化。 2、你跑凝胶柱的buffer可能还需要调整下，蛋白之间可能有聚集。这种聚集不是由二硫键产生的，可能是离子强度，或者蛋白的疏水聚合。 解决的办法，第一就是尽可能做出来的蛋白马上上柱，二就是看看buffer可不可以调整下，改善这种情况，无论是利于保存，还是跑柱用的。