【上传】PCR克隆—— 告别PCR产物酶切和T载体
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发表于 06-10-19 21:20
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【上传】PCR克隆—— 告别PCR产物酶切和T载体
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PCR克隆—— 告别PCR产物酶切和T载体 PCR扩增后的产物往往需要克隆到载体中，传统的PCR产物克隆方法不外乎以下两种： 1.PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是定向连接克隆，筛选方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难，另外酶切连接过程本身也相当的费时费力。PCR引物设计时在两端引入酶切位点，由于部分限制性内切酶在酶切过程中需要在识别位点两端留有一定长度的“空间”，有的时候识别位点两端的碱基序列都会显著影响酶切效率，PCR引 |
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发表于 06-10-19 21:21
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Re: 【上传】PCR克隆—— 告别PCR产物酶切和T载体
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根据线性化载体两端序列，在PCR引物设计中分别引入15个碱基的载体末端序列，使得PCR引物“外侧”带有15个碱基，分别和载体两端序列相同。这一步是关键的一步。PCR两端引物设计时，在目的基因同源序列的两侧分别加入了线性化载体两端各15个碱基，PCR得到的产物两端就分别带上了15个和载体末端重复的序列。无论载体用什么酶线性化，无论是5’突出、3’突出或者平末端，都只要根据线性化的载体5’末端往前数15个碱基设计即可（如图）。虽然合成引物时比平时多了几个碱基，不过考虑后面的方便和节约省事，还是很值得的。
得到的PCR产物和 |
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