紫外吸收法
) q4 |1 l* i* z8 e! s8 a0 E/ a/ \原理
4 ~0 [3 u7 ? n! _: ~ 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
' h3 Y) D+ j2 U/ ]! N 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
$ @5 E# l1 A, T6 s$ R- G 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。
7 n: e2 C _7 v" l! ~2 [
此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。
, y! }4 h$ u/ s: a& I1 Y1 `" ~" L 下面介绍四种紫外吸收法：
: ^% f# p0 G4 J" h1. 280nm的光吸收法
1 H( _1 I' `& z: U8 j 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
* t. N5 Y7 m) s, j* F0 |- G/ e" \ 测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
+ W2 ^4 @! t/ ~* _1 }0 ^) t# W
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。
: F6 _% m) {- k- V 蛋白质浓度 = (A280?10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)
) }7 m8 c5 v9 h* { W5 ^' Y
(( 1%浓度?10mg/ml)
+ y* K) c. l6 R' P/ E例：牛血清清蛋白 ： A1％1cm=6.3 (280nm)
2 {1 }, v. t2 M6 r `/ F$ j' y
溶菌酶 ： A1％1cm=22.8 (280nm)
# m/ Y# @, |9 \ 若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。
* r6 U7 h( @, O; }- `& u
标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：
* c& W h' U$ f7 l1 i g: P. X管号
$ M3 p3 F6 H+ B2 Z) s | 1
/ X4 _) c& }$ k; Q& n | 2 & V' W5 [4 G* H7 U6 V6 t# Z4 a
| 3
+ g- {5 K* `( q | 4
8 Y6 m6 b# W' n | 5
% z( {3 E B% G2 Q u" H% u D | 6
$ t, o) ~; B; }" [/ M |
BSA（1.0mg/ml）
, W0 `: ~1 E8 r. ]; X# d | 0 , C* y; }. X! v) k9 z H
| 1.0 9 Y9 o5 J: P; n& f) a$ g
| 2.0
' [2 i, j4 K: _2 y+ ?4 ^5 n- K9 t( q2 k | 3.0
: M* F6 z# ]! h; o | 4.0 & M+ e$ X: ^2 F* U, a7 Q, u& y8 e
| 5.0 . a. N! i; Z3 _ X" }7 |* |
|
H2O
4 ~9 |6 B2 a# q! U- S0 g3 H# H; r | 5.0
$ f) n0 h- O6 p' P- k# L6 T | 4.0
; T: n) r: a6 W2 P1 g) _ | 3.0 . k$ F1 E; G+ h. c! S: O" c/ u
| 2.0 ! E W8 x, ]7 b$ [
| 1.0 w+ g: C( a3 {, A' d
| 0 1 o* i( Y0 s; p5 {) o1 o' t" J
|
A280
7 E$ j# I6 _" } | ( u( ~& V4 Q3 I2 t" n
|
" R: d; g: h( }7 d( x, z$ t) N5 o |
3 g. n( a" I5 ?3 z1 `$ V |
/ Y* `+ ]5 l3 n9 e- C/ L | Y. J$ y. s* b' G
|
# o$ q( [% S1 k- u5 l% a) B |
0 ~ H0 h$ S) A$ b1 b7 C4 l# {. {2 w8 P% M
用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1%1cm,280nm
, U/ r- \ ]! p7 [9 s5 i
2. 280nm和260nm的吸收差法
0 D) B1 }7 ?8 z4 y8 y 核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：
) I; H) G& o8 F T) b: |- }& Y
纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 ? 1.8
9 \0 \$ q+ ^: K* ] 纯核酸的光吸收比值： A280/A260 ? 0.5
2 A/ L! W+ D6 r' I
含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。
8 }" N4 S, H* }. p7 J) k. V 蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)
' k# ^4 e9 ]& m' r2 H
此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。
( U6 j4 {; }% N( p6 y* U
3. 215nm与225nm的吸收差法 O ?, ~- @5 y' Y3 a' r5 U
蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
; C- |8 ^8 G% B! _. R
用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：
0 `- n, I6 {5 ~ 吸收差D= A215 －A225
5 ~ i) Y' [, L1 [, x
以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
3 Y2 \7 l9 O5 B q
本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。
% z+ @7 j& g. |8 p' \- C4 D) r
4. 肽键测定法
* m& [8 a' M4 Q# } 蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。
4 i( B+ w% O' z+ Y 进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。
* T! R; n; U; Q, G/ D
本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。
& p5 L: r0 u6 R" @, u& j
3 w9 c/ t& K: L2 n v; L' t
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