等电聚焦凝胶电泳

* C+ _$ [6 I6 g& ~$ E9 _主要内容：! c& J5 Y6 H5 Y# @1 ?* `9 x
1．等电聚焦凝胶电泳原理
) o' ^/ b8 [# I; y5 n2．等电聚焦载体两性电解质的选择
2 G- T3 G) y% m2 q3．等电聚焦电泳3 y3 _& z5 }/ l5 c& n
4．天然等电聚焦电泳的修正方案
+ b: a4 l- q: S% K+ a1 B5．等电聚焦注意事项
" s. G& D9 G2 r: \' o8 q; k! {6．固相pH梯度等电聚焦简介+ R2 \! m6 r1 \7 l1 V; d. j
7．固相PH梯度等电聚焦电泳
" V+ E+ I. {0 \. ~) V6 z8．固相pH梯度等电聚焦分析讨论
! T# p1 I! f- A( y9 P* T( q$ o5 g
声明：0 P5 B! D# P; X# V; f8 u
1、 本篇涉及的资源主要源于网络及相关书籍，由酷友搜集、分析、整理、审改，供大家学习参考用，如有转载、传播请注明源于基因酷及本篇的工作人员；若本篇侵犯了您的版权或有任何不妥，请Email genecool@126.com告知。
% R. y! ^, u/ P% v4 w2、 由于我们的学识、经验有限，本篇难免会存在一些错误及缺陷，敬请不吝赐教：请到基因酷论坛（www.genecool.com/bbs）本篇对应的专题跟贴指出或Email genecool@126.com。
$ X) x! n- t* J% U  b0 q致谢：
" a, }) |& y3 L; q# G! O7 m整理者：phyllis  审改者：db  nano  ! p" `, u/ G5 Q4 [! ]& U
主要参考资料：《蛋白质技术手册》、《蛋白质电泳实验技术》
  V$ ^2 [7 A2 X9 @8 ^9 X+ y# J% K9 u7 _$ `+ _# e8 H5 d& q2 [
, g. Z3 V1 i* u

! F4 t4 S+ f' o. b$ o[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:50 编辑 ]

等电聚焦凝胶电泳原理

# o* @2 q% l. P3 u  b  `. j　　等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离的技术，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。
2 a" h8 _* e; {        等电聚焦中，只有在凝胶两端给以高电压时，才能获得较好的蛋白质条带分辨率，这就需要非常有效的凝胶冷却系统（否则会导致烧胶），即凝胶同期周围液体之间的热传递效率要高。由于平板胶热传递能力高，并可方便的同时比较多种蛋白质样品，所以平板胶用在等电聚焦上的居多。
$ |) r0 m. X) g1 j( I) ^: c" S        由于等电聚焦对蛋白质的电荷差异非常敏感，若要好的重复性，制备蛋白样品时一定要小心，要避免任何对蛋白质化学组成和结构的修饰。另外，蛋白质－脂类、蛋白质－蛋白质相互作用可引起电荷改变，进而导致等电点迁移或纹理现象。除非特殊需要研究蛋白质－蛋白质相互作用或者必须保持蛋白质的生物学功能，等电聚焦通常在含有尿素的变性凝胶系统中进行。使用非离子去垢剂也可以提高分辨率。" w. i) N) w, @
       等电聚焦的缺点电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。, |" D0 X; q# x8 y3 I  {$ M

4 D2 M' O# x3 w1 I0 A[ 本帖最后由 phyllis03 于 07-8-14 13:25 编辑 ]

本帖隐藏的内容需要积分高于 1 才可浏览

0 Q1 K- r2 L2 H: ]+ I, g  _8 _0 e, W0 N( U
[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:52 编辑 ]

本帖隐藏的内容需要积分高于 1 才可浏览

- {; z8 n0 F, {& K. d7 {& [1 D# T
. U1 a: f/ C( Q[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:52 编辑 ]

天然等电聚焦电泳的修正方案

3 G9 K1 m. L2 T5 Q0 F' G     如果要进行天然等电聚焦电泳，要做一些修改；) y/ }! V1 {' {* _5 ~8 e
1. 胶过程中配的凝胶中不需要加尿素；
( U) ^( N' P' e7 q; Z2. 上样缓冲液（2×）5ml：其中1.8ml水，200ul载体两性电解质（同制胶成分），3ml甘油，上样时候于等体积样品混匀，10000×g离心5敏即可上样；
3 `+ a" A! `) Q  w0 x! X: [7 p) ?3. 室温下电泳，接好电极，恒压下先200V电泳1.5h，再400V电泳1.5h。

本帖隐藏的内容需要积分高于 1 才可浏览

5 z# F- v+ I3 N$ t
9 g- F4 S. s8 N! _8 Z3 F$ J% v5 F
[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:53 编辑 ]

固相pH梯度等电聚焦简介

5 m$ y$ Y0 F9 E8 Q　　固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种等电聚焦技术，其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物，它们于丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺有相似的聚合行为。固定化电解质一端的双键可以在聚合中共价结合到聚丙烯酰胺介质中，其另一端的R集团为弱酸或弱碱，可在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可行成近似线性的pH梯度，所以固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是两性分子，在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变，后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法之一。

固相PH梯度等电聚焦电泳

3 u8 l/ p; N9 {4 A) X5 B( m; F+ Q" ~仪器试剂
6 g) F3 s$ ?7 m. V. y! Y% R( @　　仪器：Pharmacia公司IPG Phor系统+ U2 E4 E$ H/ \* q2 Z9 |
　　试剂：7 Q  S3 @5 _9 _
1. 丙稀酰胺；
0 @+ s! O  U5 j5 }" j. c2. 双－丙稀酰胺；
9 Z0 @( Q% |1 o% t5 X4 ]% l3. Immobiline II；& _; p& Z( e0 s6 V
4. 过硫酸铵；! \5 G2 l4 N6 L- }9 l* ^8 t1 i+ o
5. TEMED7 K2 v( b/ P5 u( F7 P
　　储存液：  w) X+ g( n6 P9 O2 w2 o3 N
1. 溶解14.55g丙稀酰胺和0.45g N，N‘－双甲叉丙稀酰胺于40ml双蒸水中，溶解过滤后定容至50ml，4摄氏度可以存放2周。
; @( k) s. o# z4 V2. Immobiline II，使用前将储存于4－8摄氏度的Immobiline II溶液于室温下平衡半小时。- a7 m7 q# p8 v7 ~# E
固定化电解质的选择
8 l0 W) A2 e% a1 j; U# ]; L　　固定化电解质可以分为酸性和碱性固定化电解质，分别含有一个弱的羧基和氨基，商品化的固定化电解质有6-7种，但是实验室已可合成不同pK值的丙稀酰胺衍生物17种，利用不同pK固定化电解质的组合可以配置不同pH范围的凝胶，甚至一个pH范围及小于一个pH范围的凝胶，现在已经可以从10种不同pK的固定化电解质中选择缓冲离子和滴定剂，设计pH2.5-12任意宽窄范围的pH配方，也有很多中pH范围商品化的固相pH梯度凝胶出售。
) W; D  F# A3 u9 s　灌胶：
2 l) ^9 D2 ]5 F2 o) T- q+ @4 P通常将酸性固定化电解质作为重液，碱性固定化电解质作为轻液，下表为凝胶配方：                     5 b7 }4 d* K- [( O! v0 T/ c
表2  固相pH梯度凝胶配方
( `  G/ ]  s# A! k3 q% @

贮液' C5 N& b1 [* V5 w6 A3 r( u. W	重液（混合腔）* g' u8 P0 g# Z1 T/ J. o* i	轻液（贮液腔）/ M( s/ ^: J9 k' k/ e1 ^; z. v
缓冲固定化电解质% H8 U. a* i' q- H	ul 6 ]* z  t7 t# a0 v) N	4 p0 f1 K/ R; H- D) Z" cul9 v& v9 L6 y# {/ }) M* u
滴定固定化电解质1 e- h! P- ?$ I6 j9 M3 Q/ E	ul ' S9 E# ^5 i1 u' q) j	ul - I- V1 _' `! ]1 K: H: `5 p
甘油 . e/ B% i% @7 {" ~	2.1ml# z$ R2 ?+ b" M: ^3 K% K	――9 N8 X2 Y% o. i5 F+ j& B, a. I
丙稀酰胺单体贮液# V8 U9 g: e8 g- i	1.25ml" V' J( i& E: R' j% s# w/ R; e) x	1.25ml 9 D# a) J- T7 E
双蒸水定容到 + Q2 G* f1 q. S& N6 ~	7.5ml- X& C; Y8 ^% [9 s. r3 p! [/ l/ M8 o0 g	7.5ml 5 Y3 \( B$ e& }( K# W+ |% _

4 C! I7 O2 R8 l) B
不同pH梯度范围加入的固定化电解质的量不同，参见下表3 K0 I8 q3 s, G7 g  w+ V
           表3& {8 m; A. j$ E
# H2 t. I) |" i; }* i% c. r/ z! {

酸性溶液体积（ul） 2 F3 y3 f7 G  H* z# [$ q9 j

碱性溶液体积（ul）7 h* Z; ^3 [% T

0.2M固定化电解质pK8 U6 _" g1 h7 o. D+ q

0.2M固定化电解质pK- B* M! {( P8 d. {

3.6$ [) y! S9 `5 c6 O4 l5 I

4.63 j9 g* [3 j7 q6 e+ b  P+ x9 @

6.2 / e: q9 k& n: _& B" H3 U

7.0) }. X8 E: b& I' K' B

8.5 " x5 n. r  X8 B7 r# f& o' i

9.32 n6 j1 ^7 t% q+ s: {3 K; ^6 P

pH范围 % L5 j$ ^. J0 y4 U. \2 f

3.6: R2 ?% B& ^' w; b8 n) X. x

4.6 1 [+ D5 y2 \6 k8 ^' T* p

6.2 6 M& z( U2 `& c( y# ~

7.0 : ], N8 G4 o! H' {0 @$ V( b/ ^+ s

8.5 0 S# {7 `# f. l; p. v% F5 Z, d

9.3  e7 u% m3 @6 {, {- G# M

299( |8 z. B- Q  [5 G1 s

223 , M3 |9 t- Q& z/ i5 Q" b5 S

157 + T/ V) M7 |+ s: p8 P8 h

& `7 \! g- S6 F2 i

/ |: I& Q5 D5 q# ~  W! }1 ^6 r

1 J+ A' K1 R3 M- e  i

3.5-5.5+ M" }/ X/ ?- w2 Z9 M* {

212- r& e: y  S" f

3107 f' q7 ?2 _0 `/ [2 R

465 1 p: ^1 y$ R2 \- \' _* t

! q7 T% {1 T5 b

( ?* ?2 U, p; ^+ b

- J$ S: @3 P" Y

569- u7 N  |) c; h' G' d

99 " k/ ]8 W! y* S# N

439 / J. ^' t; _& B% n7 ~0 x8 Y- P

; g( n0 U: x' h7 Z# P: @, @9 [: s

% n# O: u" X8 e) _1 `7 k

' `  k3 z0 V/ r

4.0-6.00 G+ R+ D( L: _

390 5 P6 ~  I5 v0 Z. G5 h/ H

521% f) H. l2 M0 [6 n) y5 @) H

276   t& M; ]4 X6 u/ \7 K

1 T( J+ K2 m  {

* w' m  ~: y" P  a

722; E9 p, r: w: o9 ]- I. Q+ F

415& G, a! w, G& \; e. M$ n; V; B

240 % h0 d6 W6 W. G  z) ?

499# d! m" n; c% {' i' L

- k) A2 ]- h. U3 J

( L; y8 B9 _, N6 G

1 U% ?) `9 _& h* P! T

4.5-6.5/ y: L! y! S; ?4 o# z3 h

) C4 m; _; p1 j7 H& f& S

5703 P; u. r. ^0 ?( I3 l0 y  \: B" y

244% }  {0 |8 V: s. g; k$ c

235! O0 G( F5 Z6 \  g3 z& w4 e" B

$ U2 t6 z" B# }; p' U  r; X

297) [2 c6 S" n/ d; `; \6 E5 L/ E9 c

69 . h1 w0 [4 ^' ]8 i7 y/ z

428' {  l9 U4 @! a

414 7 u; ]2 C& M$ U* g- M) X1 _

z' b* z; r& A

g, D+ P3 ~5 k! v$ D5 M7 c

3 ?- h  Z, Y" Y* |* ~  }- \

5.0-7.0; s7 R- b0 B, w2 P( f9 b# n

) I# U5 {# H* _3 T

474 8 ?' c/ H$ O' i: q! y# }( w' }2 C

270 , E1 V# B' f' s  |" B

219+ [  d; Y+ V) K# a, ?0 m) O6 |0 E

0 f7 P2 s% i% j& ?+ A/ q; }3 r3 i+ l

320% S" D% e! P5 t9 B) Z8 V

W+ B" M, ]) S8 R0 [7 U  o

450* e1 l: F1 T2 M# O' f

354# P/ g5 E- Z: x1 N2 N8 u% R

113 & S7 w& x  i" B+ f  a+ }: Z

& a% j% i' q4 K

( F3 o. {- d6 ^5 C: L( x

5.5-7.0 % v5 [0 T7 g9 P! D' u; r" k2 g

347. G$ G" m! x. U* q' {

! R: O* B" p4 g) e0 @+ j2 K

236 ' a& Z5 E% V: [, a( r7 ]  j, r

287 2 H& L  `3 E3 I8 |. ?  q6 s

2844 y0 a$ @) s% Y. ?

( S# s1 D, h% u5 C; n4 g

435& v  d, K& J3 \% s+ x( i

. p6 s8 _, d+ x: M) W  h. _

323 7 i; T0 R5 W* G4 Z- C

208 9 b0 o/ ~0 y. n

44 ' H& e7 H: D8 X/ Y

- E+ u% C. l, U! t% Q

6.0-8.0 / o5 L5 y) K% y9 |

286 + _* U( j& L8 X' g1 R! U" d) V) q

/ r+ \! d, L2 i. P6 l

174 - c! _5 y# M0 m- X% b

325/ f5 H, F+ x# B6 L

3293 I+ b! ~' d6 F" x* z' m, z

$ _& n  _* k1 p; `5 [

771 ' z' i8 T! Z& Y! w) ~

: a9 J( g, ^& \  f. v1 k& v! C, z4 g

276 , Z2 {4 ^% X) K5 s' a

185 % j0 L5 y% v: E

538+ |/ K3 r- U) `5 T* u/ Q5 t" R/ Q

+ N- i8 O% C8 Y+ x4 e

6.5-8.5 " G& F# h) ?% ^* O

192( n" }3 V/ V$ L

9 G9 d! Y* F0 a" g2 m. v

153' j$ h: q# E5 @$ ~& _

278 : @+ m* C' Y; t9 k2 o4 ?

3623 G' H' q$ S1 V) M% V

4 U1 S  x7 V5 X; G; i1 D% a7 s

13497 }4 X5 |3 H% ?( I3 e/ m

9 a/ h# W; y7 e

2724 \0 T) h2 Y  K( r0 y5 O# L

372 + r; e7 D* p( z& `$ n8 K0 B

845 * o  V& }: `2 J

( Z+ T0 v/ t9 A  }! Y

7.0-9.0; d; K9 W5 d3 j' E/ c& {; l/ g' @  _7 u

207 3 T/ u! {# Y2 l: z# Y6 f) |

& y* n6 G0 Y2 |5 b' x+ r

, R* U# Q3 }8 t4 U! \

925( |' t, u( E0 y

139 - \( w. j3 o$ R/ E, x, T6 I

346; z- @' N0 G$ Z7 s' }+ G$ D& \

399 7 T# c: @. X/ ?9 f  ]2 H0 y

+ M  V4 P7 W3 X4 d0 J

) i  q/ j! R; Q( g# d" z

364  u6 ~- ~. G& z3 [0 j3 r

3559 j/ @; E, ~( [' s, L6 t- }

94   k& I9 Y7 {) x- ]: X6 |

8.0-10.0 7 k! [" r. u$ G" ]5 j

91 # U; [- A3 ]# t2 ?( K7 I! A

3 Q& V" Y8 ]0 K

# i6 m- N  q/ ]

329 & ?2 a9 a' E$ g: U

366 & o$ m' J1 J' l9 h, t

289& s2 B6 L# D) Y" S7 n- X) F

587 " m5 `9 t' I2 x2 J. x0 }* K; A

1108 @' y) a3 a- N+ E

450' `; P4 k4 `. U+ B

6 L% h5 A# U! T" ?

& P1 i0 ]% ^- p; Y; e) d

1 P, o; z6 w& Z0 ?% W

4.0-7.0  n; N# S; g9 f3 D3 ^/ }

302 " g( K. w/ f9 W4 ?2 d% S

738: [$ m5 t" I/ ]3 I6 O+ C$ Z

1517 p9 R$ C# W. e: ^, k

269 ( p7 |7 R$ m# p4 U- P& O

1 T) C$ W4 l( R0 c

876# M  D$ q) U6 y( [

702' P$ K7 N# c' z+ j% N) o' {

254 % r5 b, R3 I8 I( V$ m" f5 u; @

416/ d% q" |( a* f8 g* T8 r, p

1337 Y: s1 t) X* p; _1 q2 a+ Y

346 - _9 \3 h% g' b, A* F

4 x* |# z2 h. [! n+ w

5.0-8.0. j9 s: Y0 ^" M1 d0 F

1756 Q$ D. k; h6 `! F! p, h

123: B/ Q4 j1 }7 ?

131 , J4 Z$ ~* D" o9 V

345 ' [" a+ o+ g! X% \0 J9 E$ I3 B. U3 P

346 * j6 `, p- Y+ T# g5 b0 Z

& b# P9 r7 K" w% b8 p3 e

779 5 h: h$ {8 V  B+ z/ `, |5 \

5 s1 e& B" \4 Y8 Z( w1 G+ Z

402 1 _1 U4 d( [6 u, A2 R/ z/ F+ `

93) k9 b/ x) v/ c+ A

364- u, l! g6 I) E  @

90 4 B( }) O" q$ K$ F$ t

6.0-9.0 , b& o) q2 \7 Y* ~$ Z, V, c

241   D" p9 }2 ?$ U* l1 c

4 k! Y0 ~+ h' j9 J9 b( ?

161 " M7 g% z  p, W, L

449$ k8 l3 g2 E7 Q! v' Q/ Q0 U* T, l, V

237 0 @$ L. h% V. T2 i6 F  }7 E- G

225/ X! }9 k" N4 M8 r, U( y% m# J

542  w4 G: \9 S/ Y: Y" k5 T- i4 \7 s

2 t: }9 l! l/ ~+ A3 o$ {# r; Q1 t

3 b* H" L7 v% K6 f0 Y( z( a

378/ `+ _+ f8 n0 `. h1 l

3518 Q( D! l1 f' B# k$ p

" m% a5 }' V8 _( Q4 a

7.0-10.0/ z! u. Z" x; _5 J9 S6 S9 |

90 * V4 m- @7 f/ |, A9 P! M3 T8 c9 N

/ \. z/ \/ N/ k7 B+ g

6 v$ t3 Z$ \6 B4 z/ F

324 ; k9 y  k" v$ T& b  B

350 . F1 y& f9 P' r- S3 q  w

2807 f: B0 @1 v; \

588" Y  V+ b; r" E9 g& [+ A

254. ?- b) S) m& l$ Q: _: N! N. S# \

235- ]9 L- \4 w. o1 }, I

117 0 m9 H& q. k# y  C

170 1 c* z; G* w- x. E. ?" n

$ L" s4 x3 l: q8 M

4.0-8.0 + }0 R. _! w4 w0 n* u

9 e! U) D6 Z. [( U  h

554 8 n" m/ F# t- R) G$ i5 k2 m" z

360 7 y7 j" Q/ k' O% \3 [& S

142 . _; k) K" E' H/ q9 \. O

334, F# W( G& s4 l6 M+ X- N

288 * v5 a: H( I! w8 i& i% j

830: @, b& _$ e6 S8 v- p7 W" U: \1 U

5820 q; e3 M( m# x+ V: T0 M

218 ; I# r9 g$ o1 }2 r3 ]+ N$ _

138 ! C1 I; ?4 }1 u; z7 Q0 ~* Y

795/ H$ U/ D5 t% r4 u1 A' [5 z; B

122 0 P4 V" P. H; r5 [" c

5.0-9.0 % e' s$ N' E3 S" O

1 e: x0 r. a0 o- E9 D! B

249 % C* A# c1 h# s) Y

263, R4 u7 n; z! ^3 ?" A: @

212 2 v2 \! H( {7 b8 W) }

292 2 ^2 t  l. {& K5 N7 N

230& M+ y* x8 F6 y9 N( ]! S8 i

941 / b  q1 ?, c8 ]9 I: U$ j

+ L' H! f4 g5 r/ w" g' Z

273 ' H' C7 r! H( M0 k# v8 n% d

243/ _6 V. I5 u& e3 X1 e% B% X) s

260 ; p8 U9 R8 {/ a- [. v' Z% L

282   `# l, a% I# `" Q6 e# W3 O

6.0-10.0. c0 K0 u, e* s% N# q1 |

100  c' N6 D& a$ s# {" r' ?

8 j& }8 M/ T9 _7 h' M

333) A0 H  B( H6 t

361) k* q4 `) z" K9 Q

2392 q1 ~0 Z( Q! ~% g, k& Y

326! a9 a) [  l, A' S5 S. Q4 F

8293 w6 [8 c9 c, [: m

2359 o# q0 h, a% u% A  x2 M

232 / W; `$ }. X5 R- W3 F/ L

22* o: q/ j1 N. c: D

2501 @3 \' i' A0 W4 Q* s

221+ G5 P- P: w9 t  j# `: n% a. Q

4.0-9.00 {  }. f& C) W7 o: |

147 : R# u2 `) ~: M* P& M8 u: v

424 ; |, t, f$ G& s5 V9 L  u) H

360 : x/ r$ H' D7 n& t( q8 ]

296 1 z7 R; V" ?8 A/ ]# g6 {* d/ Z

71# W; J4 e+ ^1 b

663 + w6 A5 |  t) e7 l) U8 a5 q& C

563 ' o; x; r( U6 N0 B% m

4636 F( X* O! F# z  h* Y

298. u  k7 A8 g/ R8 J

273: n9 N1 M4 m9 p9 U' D9 P0 g

2270 ]/ k2 @$ G, X' [

127 % A- o7 ]0 R1 g7 U' }

5.0-10.0- W! e% e9 i" `; n; ?

21' E2 I/ d  ]2 X5 W' Y( L, `- R

596 c' C) A8 C8 e$ X/ T1 F/ ]7 s

34 ; E  z( I+ b( |. L! A

4202 ~' v) C& k$ O4 Z

310 ! G$ U; L- l) `: L2 j  h2 l

273 : b8 P3 a4 L: k0 B' s4 j: X; N& x

1102 / _4 m  x. B" |" u$ t) I

; E) ^6 V% x, L( {$ g& q

455 + W, g. B2 n( b( |; v4 Q8 e

89   f  g& R; h- v' i9 H* {# u

334, `$ o" H- Z+ l* f* p0 h4 |) k  M

8 A- v2 }* P9 u6 t( ]6 {

4.0-10.0. q+ g4 n) ]$ Y& @

. J9 X7 d. D* {6 |0 _0 j- [- o

114 & [6 L! Y* I7 ?4 J/ K. {# K

50 - _  I! k. n, s$ X" {  x

488 - ?' e7 ?4 H% A3 K' X

157 7 w$ g0 m1 B/ }) ~% v( J. n

357) ?9 ^. G, [% C$ e$ P( J0 \  o3 O

( c, U3 f% K) H4 O  `

( \0 K; J8 b) D" Z2 `7 E5 @2 b- s灌胶步骤
+ v% U4 P. ~: {7 o+ U1. 组装灌胶器，灌胶前梯度混合器的腔间阀和流出管的夹子都应该关闭；
8 |9 t! R) Z! y! o4 E5 F  `2. 将7.5ml（视凝胶大小而定）轻液（碱性）注入梯度混合的贮液腔，小心打开腔间阀，赶去腔间气泡，再关上腔间阀；* U$ H/ b# I8 O6 N7 o3 K
3. 将同样体积的重液注入梯度混合器的混合腔，两腔中分别放入同样大小的搅拌子，在贮液腔放入补偿棒，此时两腔中液面应相平；
2 l$ {* `: S$ V+ R; M' ~8 E4 U, H4. 将梯度混合器置于磁力搅拌器上，将流出管插入灌胶模具中央，梯度混合器的出口与流出管末端高度应该相差5cm，磁力搅拌器转速为200-500r/min；
2 M- Y5 b/ T; @; R8 @5. 两个腔中加入TEMED，然后加入过硫酸铵，打开流出管的夹子，当酸液流到流出管的一半时，打开腔间阀，两腔液面同时下降，在混合腔混匀后缓缓注入垂直放置的模具中；# e( L' R2 m2 q3 T( z5 `
6. 灌注完毕后，室温静置5-20min（可用异丙醇封胶）于50度烘箱中聚合，灌胶后立即洗净梯度混合器，以免堵塞腔间阀；8 |( E2 E. X5 K7 p9 d% I
7. 聚合约需要1h，完成后，取出凝胶，标上正负极；3 T1 Y3 C/ }2 s" l& h4 r. P( k
8. 将凝胶称重后放入双蒸水中（6×10min或3×1h），室温下60次/分震摇以洗去催化剂和未聚合的单体；% ~7 \* L, N/ f
9. 用冷风吹胶至于洗胶前重量相差小于1％。9 i+ o- o" _) c, X7 G, f! v
样品制备和上样6 p: ^' W1 `  |
　　固相pH梯度等电聚焦的样品处理方法同载体两性电解质等电聚焦的样品处理方法基本相同，而且要求比载体两性电解质等电聚焦的样品处理方法还要低，由于pH梯度在凝胶中已经固定，所以样品中的盐对pH梯度影响不大。: R% _0 G% y3 f9 y: T0 C
　　固相pH梯度等电聚焦通常为水平电泳，没有垂直电泳的加样孔，由于每个蛋白质被浓缩在其等电点位置，理论上将样品加在凝胶中的任意位置均能得到相同结果，但实际操作还是应避免将样品加在紧靠电极的位置或靠近等电点的位置。
1 [7 X( G& H# h' f$ ?# E7 a电泳/ @: p# C9 J7 B9 p4 n$ L6 m
　以Pharmacia公司IPG－Phor系统为例进行说明：! z; K6 ~6 G6 v) Y" L# k
1. 打开循环水浴，设置冷却温度为10度；8 c0 Y% h9 O( T# ~9 r6 C
2. 将固相pH梯度凝胶铺在冷却板上，在凝胶和冷却板之间可涂以液体石蜡或煤油以避免气泡产生，使二者之间接触良好；' U6 _* o. u- ]' r6 L6 _; h
3. 参见下表选择合适的电极液，以电极液润湿滤纸电极条，分别置于凝胶的酸、碱侧：4 D! l7 ~5 \2 g

阳极液 5 k# S6 W9 s# z9 w3 U	阴极液 1 h5 r0 w. @1 i  o1 r
①双蒸水 % Y7 o5 F1 @4 k; h' q. E$ W: S' ~	①双蒸水6 F6 D( _0 Z# R9 Z2 r
②0.3％－1％载体两性电解质 ; m" p/ a4 q/ E* i	②0.3－1％载体两性电解质 - k: T; `( x9 L2 A
10mM& |, v& b5 E3 e( T5 Y( P 谷氨酸 3 Z. ?0 P! Y) S' v	10mM : T( t, i- g8 _- G' I赖氨酸 0 g0 w9 B) x& r( v. j

8 W% X7 ^; j& o* V$ n/ N
注：①适合宽范围pH梯度凝胶和高盐浓度的样品；②使用相同或窄于固相pH梯度pH范围的载体两性电解质。0 _* r, e4 H8 Q' d9 j. I
4. 将样品加在凝胶上;: r9 e+ O" M& P" R
5. 将白金电极分别放在滤纸电极条的中心，再将阳极和阴极分别同电源的正、极相连；- ^- ~) T: U" E1 y
6. 接通电源，按照下表参数进行聚焦电泳# Z' j- \+ a5 r1 Y/ `

) K* n0 ^% y7 c  P+ b: n( d! S: ^	电压（V）   `8 e8 E4 h2 F2 D% r" l( D$ Y% J+ N; ~	电流（mA）$ B! q2 ~1 k1 o1 |	功率（W）8 u  ^/ q7 W8 h9 O	时间（h） - P9 u) A! Q$ \9 _+ Y5 Y# T+ C
第一相预聚焦 " N, S7 i! s' ?; P	3009 }2 P0 J$ N. O) p- m% M	1/ s  S" a% p- n& U	1/ x) v- ^2 ~4 Z( _	1-4& s: L' I$ O0 M# I. W0 z. t+ n5 s
第二相聚焦 % {( M6 D" D: ^3 F2 S0 \	35000 B: e% ~2 k; G  L	5 ) [# R8 D( `( u; B	10 , g1 ?& q# Y7 {+ D( F3 l# M/ {9 x	12-16/ ~! J, h2 L% ]5 r4 K9 m" F
第三相聚焦) p9 f7 h. b. m3 b* ?3 j% J	35000 \; q! f* {/ l5 c8 I	2$ s- z# v& p! ~( J9 O. }	5 # R- \: \1 Q6 f2 M* i3 D% B" q" n	2 / a. r0 Y$ i" p# l% |' [

5 Z/ I8 }) r/ x& S' @
聚焦后处理：" j, |) N# k: b, O- X2 B7 t* d
   确定pH梯度。固相pH梯度凝胶导电性很低，无法像载体两性电解质凝胶那样利用电极测定pH，对于宽范围的固相pH梯度可以利用等电点标准品来测定；窄范围的pH梯度可依据根据线性关系推算pH值及蛋白质等电点。$ h3 i" C8 {, \7 j0 B
        凝胶的后续处理。凝胶的固定，染色，干燥，保存等均与其他相同。

　固相pH梯度等电聚焦分析讨论

* b3 j. H8 f- ~* p% L
固相pH梯度的优缺点
: Z9 ^1 y- R: U+ N　　固相pH梯度可窄至pH0.1的范围，因此分辨率极高，可达0.001pH；pH梯度稳定，不漂移；灵活性大，可随意选择pH梯度和斜率；重复性好；加样容量大；样品中盐的干扰小；对碱性蛋白质也能很好的分离，无边缘效应，故可用很窄的胶条（如5mm宽）聚焦，特别适合于双向电泳的第一相，但固相pH梯度灌胶技术复杂，只能使用聚丙烯酰胺凝胶，电泳时候需要高电压，电泳时间长，窄范围pH测定困难，只能计算。/ s/ P- u6 g; |- W* {& y6 R! w
pH范围的选择9 N; `5 h! s+ N% r) h# \9 a( q
　　固相pH梯度分辨率高，故使用预窄pH范围的分离，对未知样品，应先用宽pH范围的载体两性电解质聚焦大致确定其等电点位置，再用固相pH梯度凝胶精确分离，对复杂成分样品和双向电泳的第一相，应采用宽范围的固相pH梯度凝胶。' A; `3 D$ a9 g8 X9 H+ ~6 Z! p5 g
蛋白质的可溶性和添加剂5 N& ]4 \8 _- d* L3 r
　　固相pH梯度等电聚焦时，样品的处理方法同载体两性电解质等电聚焦方法大致相同，甚至要求比后者还低，但是一些蛋白质的可溶性很低，或在接近等电点时可溶性很低，此时必须使用增加可溶性的添加剂，如载体两性电解质、尿素、去垢剂等提高分离效果。膜蛋白等电聚焦时，样品和凝胶中加入载体两性电解质可增加膜蛋白的可溶性。

顶啊，很好