Native-PAGE

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主要内容：/ b/ X7 @% e- j- p$ J
1．Native-PAGE原理
, P# C/ y. j8 z" q& E2．Native-PAGE实验方法
. V" U- V3 ~0 c0 K* I- F5 i& s3．Native-PAGE注意事项
& M# m* p4 y& K' U" k* s4．Native-PAGE和SDS-PAGE的比较
# X  T6 O& w, E) g; a6 _5．Native-PAGE常见问题分析
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) Q2 ?. Z8 E+ `: e6 k5 \声明：
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致谢：, c) R* H: C0 R' J! x
整理者：phyllis  审改者：nano  db
1 b- [" B4 d4 ?2 B主要参考资料：《蛋白质技术手册》、《蛋白质电泳实验技术》4 y/ T3 ^5 q3 x

. I* \* y6 C3 @  ]( n[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:27 编辑 ]

Native-PAGE原理

! x/ ~) Z. k$ V8 Z; i: I! _　　非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下， 对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。

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6 ]9 R9 ?# `) k$ L) ^$ M/ g[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:27 编辑 ]

Native-PAGE注意事项

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1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统；/ D/ A; }# d, R5 Z1 e6 W1 d
2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度；
1 Z4 e& l" y9 o$ [. q* S# k3. 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开，反之亦然;  n6 k3 l' A2 [! W( R* Z
4. 变性样品的离子强度不能太高（I<0.1mM）。调整样品的PH在4.0左右，这对于能否做好非变性样品非常重要。上样BUFFER 中没有SDS之外，加入样品后不能加热。

Native-PAGE和SDS-PAGE的比较

3 i. J5 i  j3 V　　非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与非变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：
3 z/ g' K$ J" a4 x) L) y1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶的有SDS。- j. I5 K) v/ }* r' N
2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。
1 v) ~# D* `- @2 H( o3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。
* S: U- _- U8 ^6 N" e' C& v% b7 [3 F4. 非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。5 j4 l( j! f) ?. R0 k7 L
5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在0-4度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。
, K3 N7 p: E/ |, H1 T　　所以与SDS-PAGE电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率

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1 L! t  L/ L% o% O* I[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:28 编辑 ]

非常感谢

我刚好要做聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验，非常感谢！

很感谢"只看该作者 "

蛋白回收时，电泳后，所回收的蛋白是在缓冲液里吗？连透析带一起电泳吗？要加多少缓冲液啊？