SDS-PAGE

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主要内容：
7 }8 {0 E6 }  w  R2 h1.SDS-PAGE实验原理7 |8 [* g+ `6 O, E% L$ T& R
2.SDS-PAGE实验步骤4 e* |/ ^: ^7 k4 o4 P
3.SDS-PAGE影响因素
! D4 U; V6 T! [8 b4.SDS-PAGE注意事项
$ @: ^6 {1 |, b) o' U! r% R5.SDS-PAGE常用参数
2 I' }3 {( \& x- ~: T6..SDS-PAGE应用
; f2 D5 R. C, B' j  @- l) B5 u7..SDS-PAGE常见问题分析
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主要参考资料：《蛋白质技术手册》、《蛋白质电泳实验技术》
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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:47 编辑 ]

SDS-PAGE原理

7 [$ x% V4 c/ S; r　　SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以忽略不计。
# K; P6 E" |& t$ e　　SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS复合物基本上是相同的（约18?），但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。

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3 u7 B) P" O6 S. \4 y( G[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:47 编辑 ]

SDS-PAGE注意事项

& v, W. ]3 g# ^$ [7 K& O0 c1. SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。- t- R  E  V8 u0 i3 p8 ]) X& m; b
2. 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10％误差，不可完全信任。
" X" O1 K( E# V6 \$ j3. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。
3 P6 E1 A0 v% o# w& D2 V4. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。
1 c) [* b) m# c5. 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。

SDS-PAGE常用参数

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　　聚丙烯酰胺的特性，包括机械性能，弹性，透明度，孔径大小取决于T，C，T是两个单体(单体丙烯酰胺和N-N’-甲叉双丙烯酰胺)的总百分浓度，C是与总浓度有关的交联百分比浓度。" d: H7 I* v, K4 K) r
        T=(a+b)/m
" n7 X2 }$ H& m        C=b/(a+b)
5 T0 ~+ y& b7 B  n# w( [      （a为单体丙烯酰胺的克数，b为N-N’-甲叉双丙烯酰胺的克数，m为缓冲液终体积）9 G1 L) q. g: D+ r7 e; h* `: H( R
        a，b的比例很关键，如果a:b 小于10，胶脆，硬
# _& w) V7 S- s( s" n' |        如果a:b 大于100，胶糊状。
- g8 Y! H& H( h; D$ g　　一般有弹性，透明的胶，a:b比例应在30。一般的胶联度是随着T的增加而降低的，在5%-20%交联度的公式 C=6.5-0.3T
( m% `6 I( ^" ^  Z" F        而T是根据分离物质的分子量大小决定，因为蛋白在不同浓度凝胶的迁移率，是随总浓度的增加而降低的。因此在分离不同分子量的混合物时，要选适宜浓度的凝胶。

SDS-PAGE应用

0 d+ N3 {" |  S  T3 E2 x　　SDS-PAGE因易于操作，而具有广泛的用途，是许多研究领域的重要的分析技术。$ A+ a; q4 Z4 n% S0 ?
1. 蛋白质纯度分析；3 v( B% r8 q5 x
2. 蛋白质分析量的测定，根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量；
/ U5 D1 O  ^8 B) V4 u% ^4 ?3. 蛋白质浓度的测定；
% I4 C& s1 h1 v' {: f+ a( M4. 蛋白质水解的分析；, g* a9 G6 c; v6 _' P5 D% p  m  X' U% I
5. 免疫沉淀蛋白的鉴定；
- g  y& m2 }2 B4 T/ I# f6. 免疫印迹的第一步；
0 A1 S* |$ \8 q3 E) M; d0 Q/ [1 y# Y7. 蛋白质修饰的鉴定；
$ y! p2 T1 H! b7 \6 R( y- n8. 分离和浓缩用于产生抗体的抗原；1 M* e: E. O6 w% }" b2 |' T
9. 分离放射性标记的蛋白质；
" n0 K/ P: A% G( T0 b- C* R10. 显示小分子多肽。
+ [# |* y' t* ^# N, s　　SDS-PAGE有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其孔径随着双丙烯酰胺与丙烯酰胺比率的增加而减小，比率接近于1：20时，孔径达到最小值。分子量低于10kD的小分子肽类，即使用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE也不能完全分离，或是显不出色，或是显带较弱，带型弥散。且分子量越小，效果也越差。8 X* D% z: R; r  f
　　为了能在SDS-PAGE上显示测定小分子量的多肽，通常采取两种方法：一是增加凝胶的浓度和交联度，在制胶时加入一些可以降低聚丙烯酰胺凝胶网限孔径的溶质分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物质；二是选择缓冲液中的拖尾离子的种类和浓度以达到改善多肽的分离效果。

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6 `+ F$ Q! U* @( \. B
[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:48 编辑 ]

哈哈，太好了，学习中

谢了,正是我要找的啊
4 c- w- v; Z  ]$ f楼主辛苦