SDS-PAGE常见问题分析
# m+ K# W$ _; \& y) e! A5 G1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？- p& l+ F K- B( c4 Z
在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
" E! t) o$ {8 O, v+ R4 W2 ^% ^) a 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
6 X0 b; b# |7 M+ j1 n+ {2. 样品如何处理？9 {# L) V5 W8 z
根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
$ d7 [1 k* |# h, u/ X
1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
( c; h1 F+ X( ?; p8 g% v) e% ?2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
8 ~0 ~- A7 N! o* x! |3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
1 i/ {6 e: n; A4 F8 V1 N/ Y3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？& c. x% _ y8 s" P
聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
0 L! z2 ]4 X1 G+ |- [
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，
* t) a/ u+ U+ r7 P( C TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；
! H4 P4 X1 \0 r: f/ F" ~
十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
0 X( \8 G5 u4 y% `# p9 S- l: b4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？9 f* o4 X) }" g. d+ e# Y
聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
9 H3 W" S a; W1 ?
一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
8 b* x! C; O) I, T$ s& @
5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？: F! Y. B4 Z/ ^6 d2 g8 h
主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
: c' _0 U$ D, J( M处理办法：待其充分凝固再作后续实验。
' u; ^; `; _$ n- C+ o* K$ _6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？
1 M- H5 b* r5 ]: [ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
- ^% U2 ~" l( i处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
" z8 l$ k+ k! [; y
7. 为什么带出现拖尾现象？
( o) b( j7 ~( W+ y ~' I! p 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
^4 c+ m5 @1 Z5 {8 ~
处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
6 I/ V& P0 s) f$ |# |( u8. 为什么带出现纹理现象？
# @$ _0 Z, F2 Q: d) h3 A* y2 W$ d9 U 主要是样品不溶性颗粒引起的。
! C! b0 r# P. i9 g! p7 M5 K# i. q
处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。
4 n0 `* w) b& G/ X+ B9. 什么是“鬼带”，如何处理？
5 i" O3 @3 m9 P! R$ D" H “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
. i, s' W% j8 m/ \. d
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
7 Y, ]) L5 l9 H/ B* W: {4 b10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？) O6 s7 M9 `+ N: _. f
我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
% { Z) D0 ]- B7 R6 k处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。
T1 l* I/ u& Q) K& m+ k: K
11. 为什么电泳的条带很粗？) G4 q2 E" v8 I. i
电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
- ?' d$ ?' D+ Z2 X2 i, z
处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；
- i1 m. s5 ]! H0 e- t
12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？
# a S& z+ A0 l2 @) i 这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。
M4 k0 j+ }" N; Q( r7 O处理办法：电泳槽正确装配即可。
5 }' L# C% R; d5 e9 |6 ~2 a# Q
13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？
: f8 T/ z; L9 S5 `: o. ~/ o 这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
" e$ E& g% M, Y' }* d! I& e5 U
14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？+ J9 L' S) c% f8 h+ l
通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。
0 g1 }9 N" \! D
15. 电泳时间比正常要长？
# l L! _/ N% a" Q% x$ b 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。
