DNA重组主要实验

的主要内容：3 ^- S& {" H' p0 W8 `2 z

• DNA重组技术常用酶
• 酶切基础知识
• 双酶切反应
• 影响限制性内切酶活性的因素
• 电泳洗脱法回收酶切DNA片段
• 连接酶简介
• 连接试验
• 连接反应的影响因素
• 感受态细胞常用的制备方法
• 高效感受态细胞制备
• Inoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞
• 感受态细胞转化效率的检验
• DNA的转化
• 质粒的酵母直接转化
• 感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议
• 几种常见转化细胞及转化技术
• 转化要点及疑难解析
• 转化子DNA的鉴定
• 重组子的筛选
• DNA重组实验常见问题分析

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致谢：
! z" u: \- b  |整理者：WANZHAN  审改者：小宝、纤夫、caterpillar、kaige88+ O9 W( J0 f& L  {$ j/ _
主要参考资料：《分子克隆试验指南》- T, s9 U9 q( c. S- r4 ~% F6 n

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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:47 编辑 ]

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- t7 u' q8 }" A1 J3 f; l' O. ^- l: ?[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:48 编辑 ]

电泳洗脱法回收酶切DNA片段

% g( S$ E5 Z0 N( |8 c0 z9 V( I7 L1、 用合适的酶切割DNA并电泳。
3 Y1 c, M  z. H3 C  c" ~2、 于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带，装入含1×TBE缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。
# [' I1 t* F" a" W3 N3、 将透析袋（纵长）与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。
6 O  d; H- V: w  ]! H, l- a4、 取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内，10000rpm离心5min。2 n- f: y0 t* Z3 U6 X
5、 吸出上清放入离心管内，加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，吸出上清放入新的离心管内。$ ?& k2 y4 D- d' U/ e' y( E% N7 B
6、 加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置4～5h。
  v! g4 v( W; m4 y1 ?7、 于4℃，10000rpm离心15min，弃上清。
; C) w' I" @+ G; b1 C8、 用75%的酒精洗涤2次，每次均于4℃，10000rpm离心5min，弃上清。
# Z4 y3 A6 X1 {* R/ |' a$ R$ \9、 真空抽干，并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。

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9 U9 A' o. \1 e# x, o, @8 b, p[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:49 编辑 ]

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  X. u, m' \& @$ z4 ?& j9 U0 w) I+ H( C, V[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:50 编辑 ]

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9 ^  X* t6 ], X- @[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 09:50 编辑 ]

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