高效液相色谱的常见问题分析
6 f: M0 ]9 \. T+ n% P. o: a4 a1. 涡流扩散（Eddy diffusion）
5 w3 s! O z0 L 原因和解决方法：流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。
0 g; S. B6 u) X$ R6 W5 X$ S
2. 分子扩散（Molecular diffusion）
* ^+ g+ S+ G( z& H 原因和解决方法：分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。
) R x: `! X$ |4 {4 B e ~: o
3. 质量转移（Mass transfer）
0 ]" k+ V3 }: s- f; W
原因和解决方法：被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡动相就向前移，这各物质的非平衡移动，使区带变宽。
: H4 O7 `% R3 }/ b+ G4. 动相流速
! ^$ a) H) W: S; Q
原因和解决方法：当流速太低时，分子扩散严重，特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速加大会降低柱效率。
( B! E8 U$ n8 E* j: n
5. 固定相颗粒太小
" V8 X- [1 \5 ^2 S# m; K# P
原因和解决方法：固定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。
+ N4 Z- F4 _" w1 B- v6. 峰拖尾
- u+ ^' \- P, `+ Q: E1 A/ O* p3 ^ 原因和解决方法：
6 E& E; @( |7 W! p, V6 y% s
（1） 筛板阻塞，反冲色谱柱 ，更换进口筛板 ，更换色谱柱 ；
* X) r, s$ H( }
（2） 色谱柱塌陷，填充色谱柱；
3 x' ~- A! R0 s! ^# E
（3） 干扰峰，使用更长的色谱柱，改变流动相或更换色谱柱；
& z1 ]- F( |" t: q( z& h4 v/ ^
（4） 流动相PH选择错误 调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰；
; {0 D8 J: d/ Q* K" N（5） 样品与填料表面的溶化点发生反应，加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂，更改色谱柱。
8 x0 |, ?% c! j$ f5 P% S
7. 峰分叉
; c& w6 j, F/ I- l
原因和解决方法：
; I. | J5 X# f& e4 I- q& E（1） 保护柱或分析柱污染，取下保护柱再进行分析，如果必要更换保护柱，如果分析柱阻塞，拆下来清洗，如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施，如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱，
# n- d+ y+ V+ ?0 F
（2） 样品溶剂不溶于流动相 ，改变样品溶剂，如果可能采取流动相作为样品溶剂。
c! Y5 o; k# G J/ D
8. 早出的峰变形
7 U* L) @6 P+ U+ ] H$ t
原因和解决方法：
2 k, G4 y9 o1 G- {2 `
样品溶剂选择不恰当，减少进样体积，运用低极性样品溶剂。
9 s/ k9 N. z1 Q( l) x% v- d& C9. 早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
5 e$ h& O, E$ u9 C( Q 原因和解决方法：
) s7 K* A9 Z8 R) J: ]* V
柱外效应，调整系统连接（使用更短、内径更小的管路），使用小体积的流通池。
: n* x7 `8 R/ m10. K’增加时，脱尾更严重
: {: Z7 ~; ?% x0 {& K$ b9 p% R 原因和解决方法：
) R" D# q5 w; ]# ]3 Y5 o（1） 二级保留效应，反相模式，加入三乙胺（或碱性样品），加入乙酸（或酸性样品） ，加入盐或缓冲剂（或离子化样品），更换一支柱子；
0 M. }" ^. p8 W. c7 `9 q9 L
（2） 二级保留效应，正相模式，加入三乙胺（或碱性样品），加入乙酸（或酸性样品） ，加入水（或多官能团化合物），试用另一种方法；
. ^9 V0 |1 M+ R5 S( X（3） 二级保留效应，离子对，加入三乙胺（或碱性样品）。
, N4 ^6 R d0 W: f) r+ I
11. 酸性或碱性化合物的峰拖尾
1 ~6 @' e5 B! N5 C4 z% K2 g 原因和解决方法：
4 `. P; ^& \% z* L) _ S 缓冲不合适，使用浓度50-100mM的缓冲液，使用Pka等于流动相PH值的缓冲液。
{& R/ k! B: Z+ Q5 h- }- f$ p
12. 额外的峰
, G, {+ [; g/ B I
原因和解决方法：
4 {0 v4 m) Z/ _# }5 Q
（1） 样品中有其他组份，正常；
% K: x: e% \. f: ]; k# ^" K+ D0 x（2） 前一次进样的洗脱峰，增加运行时间或梯度斜率 ，提高流速；
% L/ j2 Y6 n- A% @
（3） 空位或鬼峰，检查流动相是否纯净，使用流动相作为样品溶剂，减少进样体积。
3 T) h1 S6 R, n2 u& m( w13. 保留时间波动
) A# `# X( E j2 J& x2 C6 R" G 原因和解决方法
4 d% K: }' D& b+ k2 E* f6 H7 G（1） 温控不当，调好柱温；
" e0 P$ P$ }* o; b（2） 流动相组分变化，防止变化（蒸发、反应等）；
" u: [0 K- @4 f. F1 n$ F（3） 色谱柱没有平衡，在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。
6 D4 W) q8 T0 i
14. 保留时间不断变化
$ t* r% ^4 A& q2 U! O( o 原因和解决方法：
1 M( }5 c3 Z. T2 f' @# o- U（1） 流速变化，重新设定流速 ；
9 f6 }6 ~9 V, C, Q9 Q4 v( x（2） 泵中有气泡 ，从泵中除去气泡 ；
E: T0 i, r8 s( v0 G" B, ~2 P
（3） 流动相选择不恰当 ，更换合适的流动相，选择合适的混合流动相。
8 N! f; u1 M, K. R& ]15. 基线漂移
" A4 O, D5 v! p* l3 f& ^/ d 原因和解决方法：
$ x3 r5 I, L! j' b- j* h+ }2 d（1） 柱温波动，（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动，通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器）， 控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图；
! k1 E. k9 z0 Q. K（2） 流动相不均匀，（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移），使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气；
" q8 z& w' f1 S0 T% l（3） 流通池被污染或有气体，用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池，如有需要，可以用1N的硝酸不要用盐酸）；
5 w* Q; u6 ?. M( {7 j% h5 i
（4） 检测器出口阻塞，（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线），取出阻塞物或更换管子，参考检测器手册更换流通池窗；
. F$ E4 S2 G P M$ j; w f! F（5） 流动相配比不当或流速变化，更改配比或流速，为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速；
! k' {; X) g: T, j! k（6） 柱平衡慢，特别是流动相发生变化时，用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗；
1 k" n( p `" i1 [% v0 ?（7） 流动相污染、变质或由低品质溶剂配成，检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂；
+ \* E! c) u8 Y- g/ W4 l（8） 样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线， 使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子；
! m9 b( x0 a8 Q2 R& S6 \（9） 使用循环溶剂，但检测器未调整，重新设定基线，当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相；
2 i+ T3 a" v2 z, K* i
（10） 检测器没有设定在最大吸收波长处，将波长调整至最大吸收波长处。
2 Y& [- U! d* {) @& p( P* z, P16. 基线噪音（规则的）
( \% q( m6 ]/ e 原因和解决方法：
3 p: G% U$ s8 a* c
（1） 在流动相、检测器或泵中有空气，流动相脱气，冲洗系统以除去检测器或泵中的空气；
+ S: Y: ^' T4 v' L; E3 [（2） 漏液，检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音，如有必要，更换泵密封；
# _& v) ~: O9 v" w8 q6 |9 s（3） 流动相混合不完全，用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂；
8 O$ ]6 i) @, j7 l# t$ z% c. ^) W
（4） 温度影响（柱温过高，检测器未加热），减少差异或加上热交换器；
# A) K6 K$ a) K9 n
（5） 在同一条线上有其他电子设备 断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正；
, }* t& C4 W: `1 y" c" t+ y
（6） 泵振动，在系统中加入脉冲阻尼器。
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17. 基线噪音（不规则的）
, r* p( E* ? ` 原因和解决方法：
' s. E6 E, F1 }& q
（1） 漏液，检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音，如有必要，更换密封，检查流通池是否漏液；
9 j5 d. D0 [. f; ^/ O（2） 流动相污染、变质或由低质溶剂配成 ，检查流动相的组成；
1 u6 b5 m* D, x0 b) {（3） 流动相各溶剂不相溶，选择互溶的流动相；
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（4） 检测器/记录仪电子元件的问题，断开检测器和记录仪的电源，检查并更正；
0 c2 @0 U D. x" l [, p- i/ }（5） 系统内有气泡，用强极性溶液清洗系统；
( X) Z2 t, N, S& S* e! k, J（6） 检测器内有气泡 ，清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器；
' [0 ]! @: M& H# I/ R! b8 K
（7） 流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音），用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池；
. Q: Z& p' w( S' T. z5 C/ U5 n% s（8） 检测器灯能量不足，更换灯；
: O7 e7 ~ L& h（9） 色谱柱填料流失或阻塞，更换色谱柱；
# s: \3 O( b$ i# F（10） 流动相混合不均匀或混合器工作不正常，维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置。
. y* K% e* ^, e' ]* x7 p
18. 宽峰
+ v! f! r2 @% y0 L 原因和解决方法：
+ l/ _6 i5 ?1 ]6 Z2 J& n
（1） 流动相组成变化，重新制备新的流动相 ；
2 N' @, i' l' ]* ~* z4 k
（2） 流动相流速太低，调节流速；
- O1 Q" j$ g: H: o7 X: O
（3） 漏液（特别是在柱子和检测器之间），检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音，如果必要更换密封；
& ?$ o! ]4 ~9 [9 e: V$ ]
（4） 检测器设定不正确， 调整设定；
8 G! ?6 T4 d# b7 ^' U（5） 柱外效应影响， 柱子过载，检测器对反应时间或池体积响应过大，柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大，记录仪响应时间太长 ，小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品， 减少响应时间或使用更小的流通池，使用内径为0.007-0.01的短管路，减少响应时间；
4 O" ~# S% q$ P8 S（6） 缓冲液浓度太低，增加浓度 ；
% e* \: o* u6 J# V1 P' U（7） 保护柱污染或失效 ，更换保护柱 ；
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（8） 色谱柱污染或失效，塔板数较低，更换同样类型的色谱柱，如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子；
8 L U- C0 t6 {$ e/ ?" S
（9） 柱入口塌陷，打开柱入口，填补塌陷或更换柱子；
* ^; S# G F# P# m2 g. j0 a（10） 呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰，选择其它类型的色谱柱以改善分离效果 ；
; @' d! C! l$ p& H（11） 柱温过低，提高柱温，除非特殊情况，温度不宜超过75℃ 12、检测器时间常数太大，使用较小的时间常数；
% x. X0 t& p0 O; W) n19. 分离度降低
, L9 R" \" W' t) B
原因和解决方法：
8 }: U+ Z5 X8 {5 W J4 s: p8 v( P6 p
（1） 流动相污染或变质（引起保留时间变化），重新配置流动相 ；
7 {* n4 A' z7 ?; W4 }# _
（2） 保护柱或分析柱阻塞图 ，去掉保护柱进行分析，如果必要则更换保护柱，如果分析柱阻塞，可进行反冲，如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序，如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。
+ u: f0 f: N: b3 [20. 所有的峰面积都太小
' j$ ~, H) V. v. v/ d6 E5 D 原因和解决方法：
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（1） 检测器衰减设定过高，减少衰减的设定；
3 M5 q# ~/ J6 @& `' o
（2） 检测器时间常数设定太大，设定较小的时间常数；
1 [( I) U9 D" [& p6 z（3） 进样量太少，增大进样量；
1 H/ S3 e# k8 d( ^
（4） 记录仪连接不当，使用正确的连接。
& O! r' a' i0 Y: n: H* P21. 所有的峰面积都太大
0 q% H* o: q g* J0 @6 Q
原因和解决方法：
) d" b6 [5 p' R+ s" Q+ ]% {0 a（1） 检测器衰减设定过低，采取较大的衰减；
# J! U0 c$ m3 N, r: Q0 H（2） 进样过多，减少进样量 ；
: g% n7 j4 q" k
（3） 记录仪连接不正确，正确连接记录仪。
