高效液相色谱法分离技术

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主要内容：( x  k* B. F' {% l9 ?& l, Y0 o) ]  |
1.高效液相色谱原理
- S" c/ V; E; _( Z) a3 x9 B2.高效液相色谱的特点& E1 m$ I( w( M7 w3 n& D
3.高效液相色谱类型
; A8 S% W) t' c9 R: H  [4.高效液相色谱柱的选择
5 @' F/ k, R* b/ E7 D8 P7 P5.高效液相色谱仪操作步骤4 e$ |3 @# L) {) \) z
6.高效液相色谱仪使用注意- m! Y) H6 o% S9 s
7.高效液相色谱的常见问题分析
/ d  Q9 Y! S8 ?* ~( R8.高效液相色谱的应用7 x9 M$ v  |) e2 c

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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:48 编辑 ]

高效液相色谱原理

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　　高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

高效液相色谱的特点

, @8 G, \! N; t$ W1 e　　同其他分离技术相比较，HPLC方法的主要特点是：
' U$ M  h/ S9 o1. 它的分离效率高，选择性好，适于各种多元组分复杂混合物的分离。2 O, m& n* ~6 |" ^6 q  ~0 Y  e% W, t
2. 它的应用范围从无机物到有机物，从天然物质到合成物质，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等。可以说几乎包括了所有类型物质。; a: T* J3 U  y) h4 n3 R5 f
3. 它可以根据分离对象，按不同分离机理，广泛选择色谱柱、淋洗体系和操作参数。
2 ~6 O$ J* Y' l1 K$ m) q* q1 u. L* h' t4. 它即是精细的分离纯化方法，也是快速、灵敏、准确、简便的分析检测手段。+ j  k7 [6 ?2 l4 d, b
5. 它可以处理从痕量、微量到常量以至较大规模制备的样品量，可以实现在线检测和自动化操作。
* z+ ~, c8 X* x4 M- J6. 速度快，十几分钟到几十分钟可完成，重复性高，高效相色谱柱可反复使用。

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高效液相色谱仪操作步骤

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1. 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 4 r! f2 W. R0 l3 Y* {2 ?7 b
2. 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 + C& c, v) u  [
3. 打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 ( }" v% v1 |9 q, h! E
4. ?进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
1 k! o6 y. @: O! T* }* s& z5. 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10?ml/min。 2 L% M/ \  J6 O6 j9 ?* y7 d
6. 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
- e" v; j; {) L5 l/ X, N7. 设计走样方法。点击file，选取select?users?and?methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new?method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
* x3 t) u  i/ T/ @& c5 W% o0 u8. 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 5 q0 V/ q8 t' o0 o) H8 o4 Q% K
9. 关机时，先关计算机，再关液相色谱。! n9 L! j& J2 R* q" L! D' k
10. 登记。

高效液相色谱仪使用注意

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1. 色谱柱中的流动相会排干吗？! s$ A& S5 m3 Y
　　不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。
4 S+ i5 J3 I7 K& L2. 使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？
0 o( R, I" l) V. v$ g　　如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。( l' j, s  I2 d: A
使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。
5 y/ w5 y" w/ n/ g7 e, [使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。# _9 _( ]1 {# ?& c. O* R% F
1. 如何预防液相泵的故障:4 u& ?: [2 Y* r
　　要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施:
* i2 ~+ ]: r$ O' {（1） 用高质量试剂和HPLC级溶剂；
+ P0 x8 T( X: ^. U5 G, U* M（2） 过滤流动相和溶剂；
* q# r, @) h7 E% [8 _0 w4 r( o（3） 脱气；8 t) g: h3 ]# b" D9 E
（4） 每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；/ _( y8 G1 a3 y. r, o' z! G
（5） 不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；  w! t+ U1 t" K
（6） 定期更换垫圈；3 M4 r2 }5 [, M6 k; m
（7） 需要时加润滑油；
# s# @$ C8 K1 T# T) Z/ v（8） 查阅有关泵操作手册中的其它建议。 % h" l) R2 W! |4 D0 j4 [3 p+ A
　　处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳；保留时间的重复性好。在等度洗脱时压力波动小于2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。 % `# N) C7 C: q
为了使故障发生后尽快排除，平时应常备密封、单向阀（入口与出口）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件，以及更换工具。

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9 y* r* |. u& O, Z& e[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:49 编辑 ]

高效液相色谱的应用

) h- u* N: J9 A1 C  P　　高效液相色谱法的应用非常广泛，目前，HPLC在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都有广泛的用途，而在生物和高分子试样的分离和分析中更是有明显优势。?高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有机酸；⑶甾体化合物；⑷生物硷；⑸抗菌素；⑹糖类；⑺卟啉；⑻核酸及其降解产物；⑼蛋白质、酶和多肽；⑽脂类等。
$ H1 L8 y, @; c1. 作为人工合成药物的精制手段，用于除去少量杂质，特别是那些异构体的分离。值得提出的是，药物中R-型和S-型的光学异构体具有不同的生理作用。为了研究药物的作用机制，需要拆分光学异构体(即对映体)，这是很困难的工作，而高效液相色谱在这方面显示了独特的长处。利用不同类型的手性固定相与对映体能生成稳定性不同的非对映异构体，从而达到分离的目的。" Q4 f; x* b8 d0 S5 u
2. 从一些复杂的混合物中排除干扰物质，并分析其中微量成分。% o9 ]; K3 E2 g- a4 L
3. 中草药有效成分的制备和分析。
0 ]0 B. `2 ?, Z1 H4. 环境监测和污染物的分析。这在环境污染日益严重的今天是非常重要的。8 Z, Y8 }. T" }3 {- g- d
5. 食品中营养成分和物质的分析。高效液相色谱为食品成分的分析和定量提供了迅速可靠的途径，如定量分析食品中蛋白质、脂肪、碳水化合物和维生素等含量来确定食品的营养价值和品质。我国高效液相色谱技术在食品卫生领域中的应用始于20世纪70年代末，20世纪90年代后期，国家标准中开始将HPLC法列为检测食品中的营养成分、添加剂、有害物质的等的国标方法。
. E! G: R' `. U. l6. 手性分离技术目前已成为高效液相色谱十分重要和热门的应用领域。

哎~！看的懂一叮点~！