核酸电泳

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主要内容：
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• 电泳技术概述
• 凝胶电泳的实验原理
• 核酸电泳指示剂的选择
• 琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶电泳加样的注意事项
• 琼脂糖凝胶电泳迁移速率的影响因素
• 从普通琼脂糖凝胶电泳中用玻璃奶回收DNA片段
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE胶的配制
• RNA凝胶电泳
• 凝胶电泳的注意事项
• 凝胶电泳常见问题分析

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致谢：
9 D6 x; |) m, b5 Y$ \- O. L2 C7 }整理者：WANZHAN    审改者：小宝、纤夫、caterpillar、kaige88# O: E7 w: S' M  g( a1 f. H$ ~
主要参考资料：《分子克隆试验指南》8 g) _& e% D  O2 ?) o# P

% y/ i/ {, n' H# Y7 W[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:05 编辑 ]

电泳技术概述

3 I5 I' Q/ [8 H; d0 K& C, X　　电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
$ `4 X0 X0 t% D1 Q$ w　   电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
0 E: q$ N, P1 N* M& I　    电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm  14 cm，厚度为1mm～2? mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。7 W3 s; ?2 r6 c5 U
　   为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压（V），就会在电极中间产生电场强度（E），L是电极间距离。
: M7 o6 i: C  ]( X　   在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F），等于所带净电荷与电场强度的乘积。这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F’）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F’的大小服从Stokes定律，即：F’=6πrηυ式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是电泳速度(υ= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s )。当带电分子匀速移动时： F = F’，q?E = 6πrηυ由此可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。( Z6 R+ G6 X( |8 ?( I
       用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，实际使用的是相对迁移率mR。带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如等电聚焦电泳；而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的样品通过各种方法的染色，或者如果样品有放射性标记，则可以通过放射性自显影等方法进行检测。

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7 D- b% Z2 T. K1 E5 t" x  P% a[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:05 编辑 ]

核酸电泳指示剂的选择

1 L0 F9 \- u6 T" F6 S指示剂：
  e7 Q/ Z' H" n) o% Q+ d       核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。
$ U+ k' L; |1 z' z指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有：0 K7 t. Q+ ?) |  l: Z" i1 J/ p
1、 增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。8 E7 ]. {6 ]& Q& @% e7 s
2、 在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置。6 C- \9 l, N+ @! l# `
3、 使样品呈色，使加样操作更方便。) j) t2 a4 ]2 v
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染色剂：
. w3 `; `8 Y8 S. `: p) a/ }   核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色。
& I* ]0 y& w4 k  X: l" w   溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂 糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。2 Z' _: i. c2 N/ \% M
　　银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。

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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:05 编辑 ]

琼脂糖凝胶电泳加样的注意事项

# w- N$ |- b$ n# e, h9 Q  @　　DNA分子带负电，从琼脂糖凝胶的负极向正极泳动，速度依赖于其分子质量。小的紧密的DNA分子的较大伸展片断容易穿过琼脂糖介质。依据所要分离的DNA分子的大小来选择琼脂糖的浓度，例如质量浓度3mg/ml的琼脂糖用来做DNA大片段电泳（>20 000碱基）而0.8%只能电泳小的片断。- J/ j; r3 T. {. o
要注意以下几点：
' u3 v0 h5 z+ u2 W( ]! T1、 用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。
8 W# _9 ^- E9 q; h6 y2、 常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。
) f$ {# e7 `' x7 ?, w2 W9 ]3、 在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。
; W  ~7 x6 v& A# Q" \4、 在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。$ r) |) Y: K9 [* I/ z$ u0 ?
5、 电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。
6 v, I( t$ H2 Q0 m6 O8 M* y+ @( E6、 电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。
/ x; T3 D4 j; P% c9 W9 K4 G7、 在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。
. `: ?; Y! t( R8、 如果要对某一条带（如质粒）进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收DNA。
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其他注意事项：
! x: w  V4 ~4 @0 {) J* l- R. b1、 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。8 C9 e+ I: q9 U% Q
2、 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。" d5 y7 _1 ?% c' G
3、 电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应常更新电泳缓冲液。# w6 \/ Z+ h) E$ M$ x
4、 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。当加样孔大时，样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辩认不清；反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。4 G+ T6 b) H9 N
5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。

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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:06 编辑 ]

从普通琼脂糖凝胶电泳中用玻璃奶回收DNA片段

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实验步骤：4 Z( Y" u: f3 C- X! C# D
1、 待回收的DNA片段经电泳分离后，从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，放在1.5ml EP管中；
# V& x4 x% [- k2、 加入3 倍（请准确估量凝胶的体积）体积的溶胶液（以100μl 体积胶加入300μl 溶胶液为一次标准反应），室温下放置5分钟或50℃ 保温3分钟，其间轻摇EP管几次使胶完全融化；: P! q3 b/ J" z% m: R' I, W
3、 加入10μl玻璃奶（玻璃奶使用前请充分摇匀），颠倒混匀，冰浴下放置10分钟。每隔2~3分钟混匀一次，12000rpm离心30秒，吸弃上清；
( q+ b, p2 z( z8 X2 ?& j( Q4、 加250μl漂洗液（浓缩漂洗液使用前，按浓缩漂洗液：无水乙醇= 3：7配制成工作浓度），用加样器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混匀，12000rpm离心30 秒，吸弃上清；8 X5 K4 ]& {. W/ c$ e
5、 重复步骤4（尽量吸尽漂洗液）。吸取完漂洗液后再离心10秒钟，用Tip头将最后一点儿漂洗液吸干净。然后，放置于37℃烘箱干燥直至沉淀呈白色，约15~20分钟；& E! M- c, Y7 A$ {1 v  }$ x
6、 加适量洗脱缓冲液即无菌水（20μl为一次标准反应），混匀，60℃水浴5分钟，12000rpm离心1分钟，回收上清备用。重复步骤6，能提高回收率。; q4 Z; N0 @2 c8 z2 c
7、 同原质粒一起琼脂糖凝胶电泳鉴定回收片段。根据亮度可以估计回收的量。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

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实验试剂：
& ~; R  ^- U7 X试剂贮备液：
% D0 {2 g5 W- u1、 1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸馏水配成100ml，pH8.9。% P: K: a: E8 e, x- h2 G! q
2、 1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸馏水配成100ml，pH6.7。: {: a; Z+ C) Y3 m) Q
3、 Acr28g，Bis0.735g，加蒸馏水配成100ml。
( M9 ]$ D) p2 r! Z+ s4、 Acr10g，Bis2.5g，加蒸馏水配成100ml。
0 G/ R2 l5 Y, _6 s2 o5、 核黄素4mg，溶于100ml蒸馏水中。6 k0 ]/ n* w( w& l! U
6、 蔗糖40g，加蒸馏水配成100ml。
! [( E" k# l( a4 W# L0 l* M7、 电极缓冲液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸馏水配成1000ml，pH8.3，用时稀释10倍。% U5 Q( E$ y6 P' G/ H/ j& c# F/ |
8、 过硫酸铵0.14g，加蒸馏水配成100ml。
- E: H; Q- L& k) |9、 溴酚蓝1mg溶于100ml蒸馏水中。
' O  T, F4 W* M( r9 i10、 脱色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml。! s  H+ v6 r9 Y4 [! \
11、 蛋白质染色液：考玛斯蓝G─250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20ml，蒸馏水     1 `% Q; C: N8 ^( Z; k" c" ]
　　　　80ml，溶解后混合之。; f8 G% l8 k8 S% q0 w4 A1 i
12、 过氧化物酶染色液：9 g( r( L. f5 s- u- R- B( r& b6 C; u
1) 染色液甲：联苯胺─抗坏血酸染色液，染色数分钟。抗坏血酸70.4mg，联苯胺溶液20ml（2g联苯胺溶于18ml用文火加热的冰醋酸中，再加蒸馏水72ml），0.6%过氧化氢20ml，蒸馏水60ml。
$ _; V* E! g3 g' }2) 染色液乙：联茴香胺染色液，染色至少1小时。0.1mol/L醋酸缓冲液，pH5.5（0.82g醋酸钠溶于80ml蒸馏水中，用醋酸调节至pH5.5，定容至100ml）。30%H2O20.25ml溶于50ml蒸馏水中，用时新鲜配制。邻联茴香胺（o─dianisidine）100mg，溶于100ml醋酸缓冲液(1)中。用时取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。
2 l/ B, O0 o* e" h! l# f0 T% d# z0 P* r. O2 \6 L8 B" }; e
实验步骤：
; `- `! D! y/ G1 |凝胶的制备：
! U9 a" o+ z. y" |% Z5 \3 U- d1、 清洗干净两块玻璃板，晾干后按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
' |$ p: D3 D5 B# n0 r8 Q9 T2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角。把玻璃板在灌胶支架上固定好。; Z% i( C# W# l* N5 n/ N2 a
3、 分离胶：按1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1的比例，先将贮备液1，3和水放在一小烧杯中，过硫酸铵贮备液放在另一小烧杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽气15分钟，取出将过硫酸铵溶液并入，用玻棒轻轻搅动使之混合，立即注于干洁的玻璃板中。玻璃板垂直放置，用滴管吸取混合液，沿管壁注入，注意不要进入气泡。胶液注到离玻璃板口2cm处，立即在其表面覆盖少量蒸馏水，静置1小时左右，当见到水层下面有一清晰的界面时，则表明胶已聚合凝固，用吸水纸小心吸去上面水层。3 r7 q: R' B* R9 }
4、 浓缩胶：按2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4的比例，同上法制备浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟。! L, s6 D3 s2 c7 M! F& i
电泳步骤：& L! z  U& w: h& k, [8 Y0 a* o
1、 拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。
. f, n! A+ ?5 D: p2、 用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。9 p8 I- v( }& J; r5 K! W8 b( _
3、 电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。% f- a6 F/ M* q! Z9 T) |* f3 N2 W5 M
4、 凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。( z2 X% R5 Y0 N! c( G
5、 脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到区带清晰。. Y# P1 w+ r' ?  q
6、 实验结果分析。
! j+ _; f8 \* ^# v注意事项：4 I, s' {- U0 d8 r
1、 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。1 x; b. s& H- O4 G& v7 o
2、 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。
' W+ @3 `% Z; X* d3、 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。9 t5 |) A6 P/ G4 ]% l; w# p, v
4、 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。8 \8 R+ D9 S" F7 ?
5、 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。
2 j0 ?' C* c) ~. W% i' [6、 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。
  D+ W5 I. l9 a7 j) W+ h" @" [( z: q7、 注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。
( c* T1 d/ s" L- h: E* @! U+ e8、 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.
, E) I1 s, y0 G* ^; q9、 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。

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0 G7 \. t3 {& I[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 21:06 编辑 ]