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[分子生物学] 引物设计

本主题由 nano 于 08-8-12 19:44 关闭 

引物设计

引物设计

主要内容:1 y% c' y" j2 m4 G5 }7 O
) ]* o" g/ d. M
声明:" ?' ]5 K& H1 U/ L1 X1 N% f( j) i
1、 本篇涉及的资源主要源于网络及相关书籍,由酷友搜集、分析、整理、审改,供大家学习参考用,如有转载、传播请注明源于基因酷及本书的工作人员;若本书侵犯了您的版权或有任何不妥,请Email genecool@126.com告知。
% G7 U3 ~, `0 f* L7 p9 }2、 由于我们的学识、经验有限,本书难免会存在一些错误及缺陷,敬请不吝赐教:请到基因酷论坛(www.genecool.com/bbs)本篇对应的专题跟贴指出或Email genecool@126.com
# S- o5 O# ^! o1 V  y- w$ c致谢:
  ^  Q2 g" F3 E整理者:WANZHAN   审改者:小宝、纤夫、caterpillar、kaige887 d! k/ w2 E. D; W% @
主要参考资料:《分子克隆试验指南》% z( ]) Q  u" [; z1 i+ k* ^  }7 r/ J

- y$ k* o% u1 F& w: u
2 J2 ]3 c: a" ~& D: r/ P0 N0 h; V7 W  g5 {7 E5 n$ Y0 p
[ 本帖最后由 nano 于 08-9-13 20:59 编辑 ]
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引物设计原理

引物设计原理

; t9 R& h1 y1 l. l: h% e1 T$ W7 L
  引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序:序列下载;同源性比较;引物设计筛选;
: H9 [+ F4 Y* @' m. l  要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。一般引物长度为15-30碱基,扩增片段长度为100-600碱基对。引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的。按照多肽的氨基酸序列来设计 PCR引物或杂交探针是最常用的实验手段。* n0 C5 t$ a5 D0 ~
  在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中,对这些反应的质量起最重要影响作用的,就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果,而用不够合适的寡核苷酸时,常常得出似是而非的结果,不仅大大增加了后续实验的工作量,还可能一无所获。寡核苷酸,无论是DNA的或者RNA的,都有形成双链结构的潜在可能性,预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中,碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。
% f! j( w/ W9 V9 O/ Z) \
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PCR引物设计的优化原则

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/ S# g' [  J) v$ s
1 w  _, d2 g" o; E) P, N' b, k
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引物设计中的一些概念

引物设计中的一些概念

$ m+ X3 U8 H- g3 a$ f) U& Q/ I
复杂模板:是指体系中的DNA种类和数量较多,不能以此引物对所有的模板一一比较来计算其异位引发的可能性的情形。此情形下与简单模板扩增相比较,还需要遵循下面一些原则以尽可能的避免异位扩增。
9 v$ p1 W7 a# Q; V简并引物:简并引物的出现是出于遗传密码的简并性。有时需要根据一段氨基酸的保守序列反推到DNA 水平设计引物。众所周知,大多数氨基酸(二十种常见结构氨基酸中的十八种)的遗传密码不只一种,因此,由氨基酸序列反推DNA 序列时,就遇到部分碱基的不确定性。这种不确定性因物种或细胞亚结构的不同而异,比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的,甚至植物线粒体与无脊椎动物线粒体以及无脊椎动物线粒体的遗传密码都不尽相同。Premier 可以针对各种不同的遗传密码规律设定不同的DNA 和氨基酸的相互转换,这取决于被分析序列的出处。这样设计出来的引物实际上是多种序列的混和物,在某些位点有所变化,但大部分还是相同的,称之为简并引物。
/ R9 p8 \; Y& ^9 R7 JTm值:Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。
' V) S! Y# U( h4 O8 J- |5 t1 D; K△G值:△G值是指DNA 双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定。用于估测可能形成DNA或RNA双链的稳定性:在一个双链结构中,碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。在热动力学中,这样的性质以双链形成时的自由能(ΔG)来表示。现在大多采用 Breslauer等人提出的以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。为简化起见,所有的计算都在25 ℃条件下进行。此时,最接近的相邻核苷酸的自由能是:
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第一个(5′)核苷酸
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第二个核苷酸
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如:双链d(ACGG/CCGT)的ΔG是:$ I& t, j  F" E5 ^
ΔG(ACGG)=ΔG(AC)+ΔG(CG)+ΔG(GG)=-(1.3+3.6+3.1)=-8.0 kcal/mol
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Primer Premier 5.0 的使用说明

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) v: L5 g/ j( W' {% ~! l* M/ F

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Oligo 6.44 使用说明

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) r9 N7 L6 u' |& k6 y6 I) v$ X8 n( A: L& }# M
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RT-PCR引物设计

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6 r3 @/ k' J6 v2 w9 Q4 Q  _
; w# V8 ~' j3 `
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其他引物设计知识

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PCR设计引物酶切位点的保护碱基列表

PCR设计引物酶切位点的保护碱基列表

寡核苷酸序列

切割率%

2 hr

20 hr

Not I

TTGCGGCCGCAA

ATTTGCGGCCGCTTTA

AAATATGCGGCCGCTATAAA

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AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA

0

10

10

25

25

0

10

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90

>90

Nsi I

TGCATGCATGCA

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10

>90

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0

0

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0

25

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25

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0

10

>90

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0

25

10

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10

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Sac II

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50

0

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GTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA

0

10

10

0

50

75

Sca I

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10

75

25

75

Sma I

CCCGGG

CCCCGGGG

CCCCCGGGGG

TCCCCCGGGGGA

0

0

10

>90

10

10

50

>90

Spe I

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CGGACTAGTCCG

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10

10

0

0

>90

>90

50

50

Sph I

GGCATGCC

CATGCATGCATG

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0

0

10

0

25

50

Stu I

AAGGCCTT

GAAGGCCTTC

AAAAGGCCTTTT

>90

>90

>90

>90

>90

>90

Xba I

CTCTAGAG

GCTCTAGAGC

TGCTCTAGAGCA

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0

>90

75

75

0

>90

>90

>90

Xho I

CCTCGAGG

CCCTCGAGGG

CCGCTCGAGCGG

0

10

10

0

25

75

Xma I

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CCCCCGGGGG

CCCCCCGGGGGG

TCCCCCCGGGGGGA

0

25

50

>90

0

75

>90

>90


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寡核苷酸序列

切割率%

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2 hr

20 hr


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2 Y7 V, N) k9 P7 Z4 o- h* R# {

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GGTCGACC

CGGTCGACCG

CCGGTCGACCGG

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0

0

0

0

0


  c# F/ \. [7 M
) E5 X  j; n4 m$ H

Afl III

CACATGTG

CCACATGTGG

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0

>90

>90

0

>90

>90


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8 Z& P% N( ?7 Z' Y, t8 M0 ^$ ~$ L

Asc I

GGCGCGCC

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CCCCCGGGGG

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50

>90

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; s% b- y# E/ C: k) [) q

7 W" X9 R& B3 i, z4 j

BamH I

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10

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25

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BssH II

GGCGCGCC

AGGCGCGCCT

TTGGCGCGCCAA

0

0

50

0

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>90

0 L# D2 a: k- L9 m( n8 |) ]: W
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BstE II

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0

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. ^4 ?% j; n/ x% c4 i, D

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>90

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0

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>90

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>90

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$ U$ S! r+ x7 w3 k% ]/ S( h! J

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75

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0

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% I6 S4 B. _6 ]/ M3 Z6 y" ]6 H
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