RT-PCR

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主要内容：8 ]4 w  ^) Y8 W. \2 Z. q
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• RT-PCR原理
• RT-PCR实验过程
• cDNA文库构建
• RNA酶保护试验
• RT-PCR反应体系酶的选择
• RT-PCR一步法同两步法的比较
• RT-PCR反应体系的优化
• RT－PCR常见问题分析
• RT-PCR应用

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$ |# f9 }6 R5 l" y2 Q7 J& s  ?整理者：WANZHAN   审改者：小宝、纤夫、caterpillar、kaige883 B* o+ m5 S! E* B
主要参考资料：《分子克隆实验指南》
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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:12 编辑 ]

RT-PCR原理

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　　RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
& Q3 j+ E7 S7 g6 |　　RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。& [: [8 H: g( e6 ?3 J
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：
! ~* H. D) {% k" c4 [1、 依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；
7 `& M7 m2 L  ~  D$ N3 k% Z* X) Q9 A2、 Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA；
+ m( C' t( G4 x( P" C/ J' a. n3、 依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.
6 M+ c# k/ R+ ~) n+ M4 z用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。' o9 _# {* [2 |. ^' C) m- b

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2 i: C. p0 q5 Z6 ], i[ 本帖最后由 WANZHAN 于 07-8-10 08:10 编辑 ]

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/ s- r+ `5 L; F; x4 q+ e* |, q[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:13 编辑 ]

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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:14 编辑 ]

RT-PCR反应体系酶的选择

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反转录酶的选择：( k$ b$ \8 H1 t3 R
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。4 A9 M  k$ F* x$ H
2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
* z6 o2 Q8 Z* z8 A4 o' S3． Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4 G- f; {6 Y( ]7 `" h4． MMLV反转录酶的RNase H-突变体：Invitrogen公司商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。: A0 Z* k9 J# s& L- v7 m
扩增酶的选择:. f" W4 U) O/ \/ ?1 I& U* A2 Y
1． 对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶。
" p4 @1 b- y8 X2． 对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。* P8 p  S" X- Q
3． 对于大于12kb的产物使用ELONGAE? Enzyme Mix。
+ h9 `8 Z- k% m/ r( p% ~- Y% b4． 对于一步法RT-PCR，如果产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果产物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。5 C6 _( V. v/ N: J9 E) u* K
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[ 本帖最后由 WANZHAN 于 07-8-10 08:20 编辑 ]

RT-PCR一步法同两步法的比较

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　　两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。
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一步法	两步法
起始第一链cDNA合成使用：	起始第一链合成使用
Oligo(dT)	GSP引物
随机六聚体
GSP引物
优点	优点
•灵活	•方便
2 ]5 N5 @: x+ i7 ^1 z 引物选择	" j2 @: ~. y$ E6 o( P/ M扩增酶同逆转录酶预先混合
/ }( T& r0 p! c* n+ v; h( S. L 扩增酶的选择	1 Y; D, Z/ e$ x0 Z4 z转管步骤少，减少污染可能性
•困难RT-PCR的优化能力	•高灵敏度
1 l7 \+ o3 p$ S同Platinum®酶结合提高特异性	•适用于大量样品分析
2 V2 X/ ^4 R* A7 F+ j同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性	•适用于定量PCR
•适用于在单个样品中检测几个mRNA

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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:16 编辑 ]

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/ B) X* Z7 y. D% u- i[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:17 编辑 ]

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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:18 编辑 ]