凝胶过滤

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主要内容：, h8 @$ z' d" \9 ~: c% H
1.凝胶过滤原理
* U. ~& f* p8 _) L# l2.凝胶层析的优缺点
; p( v1 d2 b+ j2 O3.凝胶过滤实验方法
8 h  [8 w3 N% {/ s3 {; }" Y4.凝胶过滤注意事项9 h. e( ~$ _$ C9 T% K* {& k
5.凝胶过滤的应用
4 w" [6 P$ q+ h2 N$ j
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主要参考资料：《蛋白质技术手册》  Phytochemistry植物化学博客

凝胶过滤原理

' r8 E# P& ~' Z9 Q& y" ~" G
　　凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。
& J3 R! `. O) M1 w1 J2 D# |9 n9 @  P       具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型号很多，从G10到G200，它的主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。 : t: v; M/ W6 ^1 N5 y8 a
葡聚糖凝胶的种类与性能: }9 M6 N9 ]2 l# x# [' U/ G
        葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。
& d) q6 Q3 n" J   表Sephadex1的种类与特性：
+ H- p2 p$ s. a6 k; I4 f3 Y  Z' j9 G, i

型号	分离范围 （分子量）	吸水量 （ml/g）	最小溶胀时（h） 20℃～25℃ 100℃	床体积（ml）/干凝胶（mg）
G10	＜700	1.0±0.1	31	2~3
G15	＜1 500	1.5±0.2	31	2.5~3.5
G25	＜5 000	2.5±0.2	31	4~6
G50	1500～20 000	8.0±0.3	31	9~11
G75	3 000～70 000	7.5±0.5	241	12~15
G100	4 000～15 000	10.0±1.0	721	15~20
G150	5 000～800 000	15.0±1.5	721	20~30
G200	5 000～300 000	20.0±2.0	721	30~40

0 W& a" P% V5 b      G25、G50有四种颗粒型号：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、细（20µ~80µ）和超细（10µ~40µ）。G75～G200又有两种颗粒型号：中（40µ～120µ），超细（10µ～40µ）。颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。
2 Q0 A" }9 p, r$ Y4 d   DEAE－纤维素与Sephadex1比较：
( V; ]9 W. i( B4 w$ |

项目" D1 D  b0 H% R! c6 B  F' L	DEAE 3 D' \9 H" \. j2 w7 b4 H# t8 y	Sephadex. K3 G' ?3 H) d$ z3 `/ G- a; c- E
交换量- y# }8 _5 c/ R4 F6 G" }1 C. b	小$ E% V5 _5 M( @% }( ?9 n6 a' _	较大   a6 P4 M4 I; h. y3 k% @
非特异性吸附 4 m/ J) W" I% U% O. K& l8 h	较大 9 A: F" B% f5 J# t- g9 o	小6 v1 t# n  O' O% i
分离纯度 ! R7 T$ u4 S1 A3 S$ l	较好 . E% r/ l1 J+ c" M7 n4 n	好9 ~" E$ @4 s1 G- S; ~
分离时间. h* y8 a  [4 H9 p0 B) S	较粗 / D& k9 @: A8 u. g6 Q- t& |	较长+ v9 d# w5 T8 }
应用范围& r" z' l: Q. Z& Q2 A	较窄 + \: \, {8 Y6 {7 c+ s	较宽3 G5 W! E: E" J0 C$ s9 ^
预处理/ E$ W# K& `7 x' C7 b) m6 O	繁琐9 R/ s7 z3 N2 X2 A, U% J	方便 8 i3 y9 m$ u5 ]0 S# {& Q: t. k: ~

凝胶层析的优缺点

, i. w( C8 u* h$ b6 v) \, a1. 凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。
, Z: c: l7 l9 C  r2. 分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100％。
* n$ h4 T- E+ P+ {; ?3. 分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。
3 a6 |% K% d8 M5 E4. 应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为102～105d；Sepharose类为105～108d。. r2 y9 d: e' E
5. 分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象 。

凝胶过滤实验方法

  F7 n7 _% Y# J& z$ b( T
1. 凝胶的选择5 R8 v7 a/ u) G+ _
　　根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G25或G50，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。
1 ?" r- D1 m  x& |. a1 {2. 凝胶的预处理
8 `" K: ~. v8 x  E) }　　称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。
+ u' B& ^+ J1 q　　　　凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量 4 k$ F. ]2 u  W8 n
- a; [! e& \, V! Y' E* e, B

层析柱规格/ A6 h* [6 f; D3 s			凝胶的规格和用量（g） / o) F# |$ r* ~
直径（cm） ( [5 L6 ]! j8 Z7 H8 k	高（cm） " H$ B3 t/ ?5 f$ k: K( X	容量（ml） + u9 y6 X8 t1 N, j4 Y! R	G25( l6 D5 I9 i1 a8 a( Z3 A  B( ?, l	G50 1 ?* ~$ Y4 h* R" k6 H	G1005 J( q# M2 ^- s4 N+ Y3 I8 |) [	G200! I. n4 e: {) L' M. H
0.92 n  J+ }$ N! x9 h, F	15) m: y9 j/ P! o5 I, n4 \	9.5, o$ x; |* t5 [: F	2.55 h/ }+ v  z9 P6 S; r' e	1 $ ?: \7 e" V3 L2 J) c6 z- {0 g5 U	0.6 * V( V. Z) U1 l1 N	0.3# b- h/ O* c0 i% f) g2 `3 m' T7 U
0.9 1 T7 @9 l3 k* b	30   |  K# H* y+ Y# F* Q5 y+ F	19   ^3 Y$ f+ O) M	56 k; l8 J4 Q% {8 W. p( ]( Q	2 ! M, a1 P  G1 r: L! `9 I& @- K; T2 j	1.2 4 n, ~- S" V9 P+ K6 Z9 C	0.6 ; g2 L3 A) }  v
0.9% z2 q! M) @  n5 \. u8 v	605 n" t$ H! Z0 X( D. @	38 ; X$ \% k. [4 `1 H, Y0 V+ n/ `, F	10 1 L7 ^) B/ P% d$ V	4 $ G  Z0 E' L, p, c5 a) ^0 O	2.5$ j, K/ |3 [* d" A- p	1.2 $ e7 X8 G: U$ C% b/ Y- ^
1.6" E) t) {: \7 g( r5 l- {	20 ' x4 K+ l4 g: L  c% k( n+ C+ P; n	40 ) t, e* T) Y' J2 f1 N5 D5 m$ F0 p( S	10 ' S6 Y0 u6 b+ z: j	45 r) @4 k  O) w- }( Z3 v- I	2.5 ! d% l- w7 X1 _+ b$ a+ R! Y	1.29 W8 f# ?" z% ~! D
1.6 + \, L* `8 {' E, K8 {* i	40 : w' N! f& c3 u% w8 c; o	80  y/ s! a; B" U( g	20 1 N) \) l; B6 c	8 . U; i% w  Y2 r$ ~4 I; C	5.01 n! s  T7 C8 F# @	2.4 / k" v" U. Y5 C0 B3 O7 X! }
1.6 5 R4 s) u, Z0 _0 f# l$ a	70 8 m1 l+ g6 s6 z4 e# i0 {	140% _( ^$ X, L2 J	35 2 q& [) }) v! m8 G7 D- S	14 # n3 `( _4 Z% y	9.0 9 |7 d/ Y$ j+ x! p	4.46 n  P" V7 R2 Y$ Q+ a
1.6 $ @% _7 e! Y$ `+ ~' |	1007 o3 M0 x* r( a1 G" c4 s7 o: b	200 * J1 T( z/ C- `, @	50 # g" ^: L1 {  p* X; e* j0 |  ?+ l	20 ( U3 t- T8 D6 N  A	12.5 1 M1 W" S6 r- h* N! V! S3 C	6 4 V5 V" ^  F# K, M  t/ M
2.6) I+ ?1 B1 P/ A' ?	407 I7 k9 p, H5 l8 D# ]! c# ]	210& C8 N: i% G/ f6 f- C7 K; C! x	50 9 K$ M0 m: z) a	20 & P! l0 D6 X) M* v% ~	12; l: {1 x0 m6 ?5 ^) w7 x* o) v	7 % y+ W- C: [( w1 C3 h
2.6* ?  w8 a  Y" J# Q! Q/ G5 R. U3 B  f	70 " y& P! p) }' ~0 z; b1 y	370; F; [$ W: \$ \. D' Z9 J5 E# s3 |	90 5 B0 c! V: Y: ~	35* M/ N3 }( G3 G) @& [, G	20- Q  C' L/ B2 `6 ]( S( ^+ U: d# f+ V2 e, t6 g	12 * l% Z- B  o9 [5 b+ z, i7 l
2.6 ! `6 Z$ A0 \; m/ U, K+ A# f$ T	100 # [; O8 T9 A2 }; G2 h. _; }	530 ' v# y, D* O$ P	130   P% ~3 K/ }1 ]5 z( K5 G- P	50 0 a4 y7 h0 k' x4 n	30 ; M. C% _' O, t8 g& ~	17 ( m' k/ H/ T6 _. U
2.6/ Z- d( K' }& w# e6 l) A8 j4 L	609 o3 q7 O& N3 t6 l; R	1000$ n9 [: m6 c9 @; S9 F9 w	250 - v/ ]/ f. f6 B! ?- I	110 : s" |, H# s6 z! b/ P( E/ H	705 I. ]4 P8 F; p( v5 }	35& F( Y( e, J! L. s

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  z, G) O' y0 K( A* l0 n5 O　　为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。8 n: V6 ?! p! w
3. 装柱$ @8 ^# Q5 X0 x1 o4 c
　　层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1:5～1:25；对于纯化蛋白质来说应为1:20～1:100。
) r$ t; T) [3 O; h& t4. 加样与洗脱
8 ?- H0 T$ J( x8 Y( q1 R' O0 _　　样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。% H1 E4 B! `% y' m: N! w# n
   洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。
: z- e% L, x: n! V: U' w' [5. 洗脱液收集
: n# q6 m/ Z) q; X    利用自动分步收集器收集，并以20%磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。/ X6 y; i! F6 ~: o8 D) A4 Y5 w0 i8 y
6. 凝胶柱的重复使用与保存
0 i9 I5 O/ o+ u# H　　当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：/ K8 w7 _9 Q( n1 g5 z
（1） 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（如0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
0 N6 C! ]- ~+ q# x) q; h; F7 v6 l（2） 用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。2 Y' g% X3 A( m/ k9 J
（3） 长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。

凝胶过滤注意事项

! Q# x# t$ g. g, [' [/ Y1. 层析柱的选择
6 I; E( |) ?) }6 M/ G5 D: x　　层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。
- H) z2 w! ?7 X2 s. w* z2. 凝胶柱的鉴定
8 F+ n( p0 G/ B5 p- _. X$ p/ v7 B     凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果，关于填装的方法前面已有介绍，这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。另外值得一提的是，有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。$ f5 c. f" [9 C
3. 洗脱液的选择+ c: U/ z7 _8 |0 }
　　由于凝胶过滤的分离原理是分子筛作用，它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶过滤中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其它层析方法相比，凝胶过滤洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶过滤的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶过滤。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。* A% e& Q) b: ^! E8 c4 }( W( ]) |% r
4. 加样量' ~% F5 l1 Q* \: H5 c. N; ^. ?
　　关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10％－25％。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2，那么加样量不能超过（Ve1－Ve2）。实际由于样品扩散，所以加样量应小于这个值。从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。
/ ]( N# @) t) {1 V5. 洗脱速度/ T# x* @' A) i! C( t
　　洗脱速度也会影响凝胶过滤的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。5 s9 w7 z7 f: t7 V0 n: w  l+ A
　　总之，凝胶过滤的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶过滤要有较高的分辨率，提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。但正如前面讲过的，各种选择都有一个限度的问题，超过这个限度可能会产生相反的效果。另外需要提的一点是，实验时应尽可能的参考相关实验和文献以及进行预实验，以选择最合适的实验条件。

凝胶过滤的应用

3 s, W- M7 W7 ^5 m9 [4 G0 |1. 生物大分子的纯化, h" g+ s* n$ W& N% l3 O" F# W0 L
　　凝胶过滤是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶过滤成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶过滤无疑是一种合适的方法。例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。/ ^" i: l. f) c
2. 分子量测定
3 o8 V% }+ H5 E, @　　外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有：9 Z( h6 \+ p- ^' _; P) G) x
　　Vt＝Vo＋Vi＋Vg/ e! `; A( V3 ~6 C; p$ ?
　　由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：
3 E' Q3 Z1 d& G7 d. H5 B+ N　　 Vt＝Vo＋Vi
& C% H7 f4 P; f/ t  Y! y设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积Ve＝Vo；对于完全渗透的小分子，由于它可以存在于凝胶柱整个体积内（忽略凝胶本身体积Vg），故其洗脱体积Ve＝Vt。分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。
2 {5 I: z- I, Y; N8 |在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。
4 k" v9 @; D! [4 y# @Kav＝－b lg MW＋c
+ v3 k; O. ]  R2 h& A) m* y. }. bVe＝－b’ lg MW＋c’
8 S0 X% N( b9 I7 r& u* J: |　　由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。凝胶过滤测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。由于这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用，所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用，那么测量的误差就会比较大；上面公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对于一些纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立，所以凝胶过滤不能用于测定这类分子的分子量；另外由于糖的水合作用较强，所以用凝胶过滤测定糖蛋白时，测定的分子量偏大，而测定铁蛋白时则发现测定值偏小；还要注意的是标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶过滤的线性范围之内。, w) @4 _; ^% v8 w
3. 脱盐及去除小分子杂质
5 B! q/ Z' s5 }. T* L　　利用凝胶过滤进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是Sephadex G-25，另外还有Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。
/ h5 n( }" U5 a$ d  B# f4. 去热源物质: A* p: Y7 \6 K- O! {2 F* q# V0 Q
　　热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶过滤的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质，凝胶过滤是一种简单而有效的方法。
0 F+ N! r1 z5 t. U- R5. 溶液的浓缩( x9 ^+ H* a9 ]  D" V4 a
　　利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex（粗颗粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值。
" h1 P6 h1 W" M8 n5 k6. 蛋白质的复性- b1 i; V2 J0 {
　　为了减少高浓度下的聚集反应, 凝胶过滤层析技术也可以用来进行蛋白的体外复性。层析介质的隔离作用,降低了蛋白之间相互作用产生的聚集,使复性浓度、复性率都得到很大的提高。同时,蛋白经过凝胶过滤层析本身也可得到一定的纯化。3 l7 Z, B/ l' ~9 L' `
　　两个重要的因素影响凝胶过滤层析复性蛋白质的收率：第一个是变性条件下蛋白质的上样，第二个是复性缓冲液中蛋白质结构的变化。另外，蛋白质上样量也会影响蛋白质复性收率，因为在层析柱的顶端会因为上样量的增加而发生结构的聚集。
8 [8 L" v, h* D4 R　　为了提高蛋白质复性效率，发展了一种梯度凝胶过滤层析复性方法。在色谱柱中预先设置变性剂浓度的梯度，当复性的蛋白质进入到柱子中后，由于蛋白质的表观分子量远远大于变性剂的，从而蛋白质经过了一个变性剂浓度逐步降低的环境，蛋白质逐步地折叠复性，从而有效地降低了聚集体的形成，并能把聚集体和折叠的蛋白质进行分离。: z( u+ p$ C/ N) r9 O9 }
　　线性梯度在凝胶过滤层析中可能经常会遇到，但是有时有些蛋白质可能在某些变性剂浓度下不稳定，在梯度过程中需要尽快跨越这些浓度过程；有时蛋白质折叠的限速在某些变性剂浓度，此时需要增加此段的时间，所以在凝胶过滤层析中可以设计不同类型的梯度形式，以满足不同的蛋白质的复性需要。

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