包涵体复性

主要内容：
3 x4 i5 W& `9 [7 U/ w% U% \1.原理
) |0 d% k7 \3 \% m. ?3 p2.形成原因和减少策略/ m( I6 a3 Z3 G0 P0 E, N4 z
3.方法% S& p1 h. F6 I* s; V
4.效率和检测
/ r! q# v2 {& m  t5.注意事项
5 p, W$ T. o7 H+ z" F. s* a* x6.常见问题分析
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整理者：phyllis    审改者：nano  db" F4 q+ z+ t8 h) ]0 I9 W
主要参考资料：蛋白技术手册* L/ K; g8 q" i- x# h

% y1 s0 Q4 q5 t' e- B1 a! l! Q[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:24 编辑 ]

包涵体复性原理

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　　包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。

包涵体形成原因及减少策略

  b' j" s* n. x; f- Z形成原因
$ [6 }1 C# K6 R" r1 `: G/ d" R1. 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
" V/ J) |, ?" d" T7 v  W2. 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。! z* k1 I/ p+ i' c: y/ F4 N. Q
3. 重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。% R$ A4 e( t+ S' V; R" c
4. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
) G. T& s% k" T7 t) O$ `! A5. 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。
9 n# g6 h  P$ v8 P0 e减少包涵体形成的策略
9 S0 k1 r+ W) [& k# s" Z1. 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。 * H+ N  h5 O( Z9 e  t: y
2. 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇    类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。6 ]- G# r/ g. r+ v* A# p6 f5 g! t. @
3. 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。

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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:24 编辑 ]

包涵体复性效率和检测

" u7 \, E" |# p, L7 t4 Y　　复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。 其效果检测方法如下：
1 L& r  ^  W+ w/ x9 ]1. 凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。 ) _: c% B$ A% C) y. u
2. 光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
1 k7 @& ~, h2 F8 F3. 色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。 3 |( B- @. A% p/ u& m7 d
4. 生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。 2 Y& K) ~/ N% t" Y0 k- o
5. 黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
+ ]: N) R. `) h  v& y: b0 }3 v6. 免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
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[ 本帖最后由 phyllis03 于 07-8-9 16:24 编辑 ]

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[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:25 编辑 ]

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: z5 e, C& Z7 o$ x# W[ 本帖最后由 nano 于 08-9-14 08:25 编辑 ]

高人啊，来这里学到不少东西呢 到处都是强人。。

很不错的资料，谢谢分享！5 n5 @$ E  n( K8 b

7 e- E% t) u7 W$ n我想请教一下用AFC纯化蛋白复性的问题：我用的是His－tag纯化，目的蛋白绝大部分是包涵体，看了下说明书，好像是可以在样品中加入8M尿素，然后直接上柱。同时binding和elution中液都用8M尿素。这样的操作，在柱上是怎么复性的，收集的蛋白中不也是同一高浓度的尿素吗？怎么能复性呢？刚做这方面的纯化，很多细节都不懂。可否告知具体操作是怎样的？
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谢谢！