质粒DNA纯化
9 U2 u3 |& |: G5 ]4 O, I1 e试验原理：7 v' [$ W- o/ z) H3 R9 E
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多溴化乙锭，直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。尽管这些方法大多数均被束之高阁，但其中最好的方法，也应是聚乙二醇分级沉淀法，最近已得到改进（R.Treisman,个人通讯）并达到较高境界， 使用该方法可得到极高纯度的质粒。聚乙二醇分级沉淀法与氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法有一点不同，那就是不能有效地把带切口的环状分子同闭环质粒DNA分开，因此， 纯化容易带上切口的极大质粒（大于15kb）及用于生物物理学测定的闭环质粒时、平衡离心仍是首选的方法。 然而， 两种纯化方法都可得到足可胜任分子克隆中各种复杂工作的质粒DNA，包括用于哺乳动物细胞的转染以及利用外切核酸酶产生成套的缺失突变体。
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氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA
: v r6 {; r% q; q# u& r0 W+ U连续梯度：4 N/ z% ~6 z3 A0 F7 M3 ?3 A6 H; E
1、 测量DNA溶液的体积，按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl, 将溶液加温至30℃助溶。温和地混匀溶液直到盐溶解。
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2、 每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水）；立即将溴化乙锭溶液（漂浮在表层）与DNA－氯化铯溶液混匀， 溶液的终密度应为1.55g/ml（溶液的折射率为1.3860）溴化乙锭浓度大约７４０μg/ml。【溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内（如用锡箔完全包裹的瓶子），于室温保存。
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3、 室温下用Sorvall SS34头（或与其相当的转头）以8000rpm离心５min， 浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。
0 p0 m! T l6 ^/ |7 [
4、 用巴斯德吸管或带大号针头的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到离心管中。用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。
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5、 以20℃对所得的密度梯度以45 000rpm离心16h（VTi65 转头）、 以45 000rpm离心48h（Ti50转头）、以60 000rpm离心24h（Ti65转头）或者以60 000rpm离心24h（Ti70.1转头）。普通光照下，在梯中心可见两条DNA区带， 上部区带材料通常较少，由线状的细菌（染色体）DNA和带切口的环状质粒DNA组成：下部区带则由闭环质粒DNA组成。管底部深红色的沉淀是溴化乙锭ＲＮＡ复合物，位于ＣsCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质。Beckman Quick-Seal离心管中的CsCl－溴化乙锭梯度可容纳4mg 闭环质粒DNA而不至超负荷。如有更大量的质粒存在，将扩展为一条宽带，并与染色体DNA相重叠。这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为２个梯度即可解决。如出现负荷，可收集整个DNA区高产水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为２个梯度即可解决。如出现超负荷，可收集整个DNA区带，用CsCl溶液（ρ＝1.58g/ml）将体积调到15ml，在两个离心管中再度离心，使DNA达到平衡。
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6、 收集DNA带。将21 号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入，为尽量减少污染的机会，首先用１８号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带（杂色体DNA）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后将一块Soctch胶带贴于管外壁。穿过Soctch胶带将１８号皮下注身针头（其斜面向上）插入管中，以便使针头的斜面开口恰好位于染色体DNA区带之下并与该区带相平行。将粘稠状DNA收集到一次性使用的管内，用造型粘土块封住皮下注射针头的未端并将第２根针头留于原处。 穿过Soctch 胶带插入第３根皮下注射针头（18号），将下部的质粒ＤＮＡ区带收集到玻璃或塑料管中。
# T: ?" m$ g5 z$ i {% A不连续梯度：
5 T& A- v$ p- k# b9 z( f. d 该方法是将含不同浓度CsCl的溶液分层加到离心管中，这样可以加速CsCl梯度的形成，使离心时间减少到６h。
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1、 将125gCsCl加到167ml(pH8.0)中，制成CsCl溶液（ρ＝1.47g/ml）。
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2、 将8ml氯化铯溶液加到Beckman Quick-Seal 离心管（或与其相当的管）中，待用。
3 ^/ h1 }/ N8 ~/ s: g* S, ^3、 如有必要，可酌情用TE(pH8.0)将质粒DNA溶液的体积精确地调到3ml。
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4、 在质粒DNA溶液中加入8.4gCsCl,将溶液加温至30℃以促进盐溶解， 小心地混匀溶液直至盐溶解。
6 H6 L6 V- c. K! `7 C; a+ I% c5、 称量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好达13.2g，用天平称量时应注意去除管的重量。
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6、 加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水），快速混匀溶液直至染料均匀地分散，此时溶液瓣体积应大约为7.5ml。小心：溴化乙锭是一咱强诱变剂，并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应戴手套。【溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内（如用锡箔完全包裹的瓶子），于室温保存。】
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7、 室温下，用Sorvall SS34转头（或与之相当的转法）以8000rpm离心５min，浮在液面上的水垢状浮渣是溴化乙２锭和细菌蛋白所形成的复合物。
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8、 将22.86cm的巴期德吸管放入装有CsCl（步骤b制备）的离心管中， 吸头应接触管底。用吸管小心地将步骤g所制备的清亮红色溶液（来自浮渣之下）加入管内，使样本层位于CsCl溶液（1.47g/ml）之下。如有必要，可酌情将步骤a中制备的CsCl溶液（ρ=1.47g/ml)添满离心管，封口。
0 c& A( }% @- b& M+ ]# W1 E/ j2 ]9、 将封口的管，（与相应的平衡管一起）放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13转头（或与之相当的转头中），于20℃以60 000rpm度离心６h。
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10、 回收闭环质粒ＤＮＡ区带。
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从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭
) ?7 C# a0 p" h 溴化乙锭是一种强诱变剂，并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应戴手套。
6 V/ D+ H, O9 z6 Q% d" n有机溶剂抽提:; J/ [4 |$ {$ U$ ~
用后溶液应用下面的步骤进行净化处理。
! \$ U1 G7 i$ `1、 将DNA溶液放入玻璃或塑料管中，加等体积的水饱和１－丁醇或异戊醇。
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2、 振荡混合两相。
+ e2 P& f. r$ x8 K+ @8 ~2 y+ Q- B3 v3 @3、 用台式离心机,室温下以1500rpm，离心３min。
$ n9 k1 I1 x' `* d. a1 d6 D5 `! G( N: \4、 用巴期德吸管将下层水相移至一干净的玻璃或塑料管内。
) F' L. N5 z' D: E \0 z" K
5、 反复抽提[步骤a－d]４－６次直到粉红色从水相和有机相中均消失。
- D: p* l5 |& f6 C6、 用以下任意一种方法从DNA溶液中除去CsCl：通过微量浓缩器（Amicon）进行旋转透析，对TE(pH8.0)透析24-48h，并换液数次或者用3倍体积水进行稀释并于４℃用2倍体积乙醇（即终体积相当于原未稀释体积的6倍）沉淀15min，再以４℃，10 000rpm 离心15 min， 将沉淀的DNA溶于约1ml TE(pH8.0)中。如果将DNA的乙醇溶液置于-20℃，CsCl会沉淀。
' B, \- Y, r; ]- a, u
7、 测定DNA最终溶液的ＯＤ260值，计算DNA的浓度， 将DNA分成小份贮存于-20℃。如果制备的ＤＮＡ含有显著量的溴化乙锭（依颜色判断），可用酚、酚：氯仿各抽提１次，然后用乙醇沉淀DNA。
2 j0 {2 I( G& e" j溴化乙锭溶液的净化处理： % z% w8 o+ m! H. k( d7 P3 ]
溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些溶液经使用应按下面介绍的方法进行净化处理。
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溴化乙锭浓溶液（即浓度>0.5gm/ml的溴化乙锭沉溶液）的净化处理：
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用沙门氏菌－微粒体测定表明， 本方法（Lunn 和Sanaone,1987）可使溴化乙锭的诱变活性降低至原来的1/200左右。
' q. [: A$ j: Q$ i# f: _1、 加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5mg/ml以下。
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2、 加入0.2体积新配制的５％次磷酸和0.12体积新配制的0.5mol/L 亚硝酸钠，混匀。【检测该溶液的pH值应小于3.0。市售次磷酸一般为50％溶液，具有腐蚀性，应小心操作，必须现用现稀释。亚硝酸钠溶液（0.5mol/L）应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml，现用现配。】
% _6 G/ `5 X p5 t x5 B3 X; G3、 于室温温育24h后，加入大大过量的1mol/L碳酸氢钠。至此， 该溶液可予丢弃。
: h' B9 j5 R' a; q. w& x1 w溴化乙锭希溶液的净化处理: @" P3 M: J3 O+ P) d8 m
方法一：
( M9 }+ X0 S6 O7 i, J4 e) w$ d1、 每100ml溶液中加入2.9g Amberlite XAD－16，这是一种非离子型多聚吸附剂，可向Rohm和Haas 公司购置。
! b9 E% j: a' o$ J2、 于室温下放置12h ，不时摇动。
2 t( {0 B5 T+ O4 P0 j! `; p3、 用 Whatman 1号 滤纸过滤溶液，丢弃虑液。
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4、 用塑料袋封装滤纸和Amberlite 树脂，作为有害的废物丢弃。
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方法二：) {" n: L. u z ?
1、 每100ml溶液中加入100mg 粉状活性炭。
7 I" u: {! w) t, _ v2、 于室温放置1h，不时摇动。
; z+ K1 }' N# q5 ?0 d7 U+ f- o, N3、 用 Whatman 1号 滤纸过滤溶液，丢弃虑液。
. x- o% y" a( R4、 用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害的废物丢弃。
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从质粒ＤＮＡ制品中去除RNA% v1 a2 K J, c7 G* k- X
对于某些用途（例如用ＢＡＬ31进生活化或用Ｔ４噬菌体多核苷酸激酥标记质粒DNA的限制切片段的５'端），必须获得无RNA污染的DNA制品。尽管在通过氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心所制备的质粒DNA中，这样的RNA污染物的质量很少，但其中的RNA分子数却可能相当可观，并可在限制酶消化反应的全部５'端中占据较大的比例。通过下述方法，可以从质粒制品中去除RNA。通过Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B进行层析
- ?& n6 J L" `- z! l1、 制备质粒ＤＮＡ。
0 ~* C7 a% @4 J8 ~0 q+ s" s9 `2、 有等体积的经TE(pH8.0)平衡后的酚抽提１次。
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3、 将至多1ml的水相铺在经TE(pH8.0)和0.1％SDS平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上。
4 S9 f8 _. d# z5 X, A4、 将DNA装入层柱并在柱的上部连接上含0.1％SDS的TE(pH8.0)的贮液瓶，立即开始以0.5ml流出液为1流进行收集。
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5、 当收集到15份时，关闭柱底部，为明确质粒DNA的分布情况，可在每份收集物中取10μg样品，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳或溴化乙锭荧光进行分析。
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6、 将含质粒DNA的组成合并在一起，加2倍体积的乙醇于４℃沉淀10min，然后以４℃大于10 000rpm离心15min，以回收DNA。
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聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA
2 R6 ~% i" w$ r1 Y试验原理：
8 v+ H1 v* y# z1 X# e* j& u 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，从而与杂质得到初步的分离。
1 }4 K0 f. P8 t, Y 此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
% Y# a& G4 J: A在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
|- {$ u: T- \% M( ^7 J3 x. J1、 中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
! o9 e4 ]' d. i2、 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
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3、 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。
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4、 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
8 P8 J2 C6 R7 U8 p8 a5、 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）
. `& B. X- N8 z+ ?: f6 T 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如20℃时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集，从而发生沉淀。另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
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有机溶剂沉淀法的优点是：a分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。b沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
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有机溶剂的选择和浓度的计算:用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：V = V0 (S2 －S1) ／(100－S2)式中：V = 需加入100％浓度有机溶剂的体积 V0 = 原溶液体积 S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度 S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度 100是指加入的有机溶剂浓度为100％，如所加入的有机溶剂的浓度为95％，上式的(100－S2) 项应改为 (95－S2) 。
3 ^, e# q5 }. E/ I* [- c 上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况，实际上存在一定的误差。有时为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。
0 K; ^3 V5 ^, _4 \/ ]8 f6 m有机溶剂沉淀的影响因素:
9 l6 Q. b& I( @# w1、 温度： 多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。值得注意的是大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。
" D, I8 a' C6 h7 G |4 Q l2、 样品浓度：样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影响与盐析的情况相似：低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。通常，使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效果。
5 ~' L8 F% B8 V3、 pH值：有机溶剂沉淀适宜的pH值，要选择在样品稳定的pH值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。
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4、 离子强度：离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白质为例，盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的２倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。
9 m1 o$ q% U" W4 @& Q/ F有机溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离，使用时先要选择合适的有机溶剂，然后注意调整样品的浓度、温度、pH值和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。
% E4 P& p f0 ?; V! |试验步骤：
L4 x1 I$ W7 A5 B1、 将核酸溶液转入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用Ｓorvall SS34 转头（或与其相当的转头）于４℃下以10 000rpm离心10min。【LiCl可沉淀高分子ＲＮＡ】
j* U! f m+ ]+ a, n6 P2、 将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）,室温下以10 000rpm离心10min， 回收沉淀的核酸。
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3、 小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。室温下用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，除尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管倒置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发完全。
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4、 用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30min。
, T) x$ ]% p; Z) l" \' ?+ ^5 j5、 加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，在微量离心机上，以４℃，12000rpm离心５min，以回收质粒DNA。
5 H1 l1 d3 N+ f8 g* K: [
6、 吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。
1 }" f: T; M' Y) ~9 }+ l7、 将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10min，于４℃以12 000rpm离心５min，以回收沉淀的质粒DNA。
9 N" x/ Q* z' i' q8 j4 m8、 吸去上清，加200μl处于４℃以12 000rpm离心２min。
" `/ M# Z* U# A- e1 a9、 吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
: T+ ?, z$ k0 l" O5 j10、 用500μlTE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE（pH8.0)] 后测量ＯＤ260，计算质粒DNA的浓度（１ＯＤ260＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－20℃。
