最近用EcoR1和Xho1做双酶切，理论上切下的片段应该约为1kb，可总是切不动。EcoR1和Xho1也分别作过单酶切，电泳后应该是呈线性了的，只有一条带。但是双酶切的话电泳出来完全和单酶切的一样。我反应体系20ul，质粒加1ul，fermentas的酶1ul，3小时。用的是Buffer O，EcoR1活性100，Xho1活性50-100，双酶切和单酶切都用的这个Buffer。

做了许多次结果都一样，想请教一下我问题出在哪里？是否需要分步酶切？需要的话能不能说一下具体步骤，多谢了。

做个分步酶切吧，先用EcoR1切，切完回收片段（试剂盒，酒精沉淀都行），再用Xho1切，体系和前面差不多就行，要不就换别家公司的酶试试

"双酶切的话电泳出来完全和单酶切的一样"，如果是这样的话，可能是没有插入片段。

插入片段是有的,和marker比较大小正确，而且PCR鉴定过。

EcoR1和Xho1做双酶切应该很好用的。
有没有电泳图？传上来看看

你应该仔细去看说明，fermentas EcoR I和Xho I的双切最佳Buffer应该是2×Tango，另外做克隆这一块的，提DNA没有用uL这个单位的，lz应该用质量表示才对，你平时问师兄师姐也应该听多人家追问“你质粒多大浓度”这句话了吧？