大家好：我现在已经构建好了重组载体，接下来想做原核表达，但这关系到一个引物问题，我想把我原来做PCR用的引物的5‘端去掉几个碱基，然后加上酶切位点和保护碱基。请问这样可以吗？用的是Nde1和Hind3酶。

请再将试验情况描述清楚一些，关系到引物的问题？具体是什么？你改造引物的目的是什么？
你是要重新构建表达载体吗？
你的表达载体已经构建好了，下一步就是转化到宿主菌中诱导表达啊，

是啊，我现在就准备做表达，但我必须把目的基因从克隆载体上切掉啊，我原来设计引物的时候没有加酶切位点，现在想用带酶切位点的引物把目的基因切下来，我的意思是我还是用原来的那对引物，只是在引物的5‘端加上酶切位点和保护碱基可以吗？原来的引物长度是20个碱基，或者在5’端去掉几个碱基加上酶切位点和保护碱基，可以吗？

哦，这样啊，你没有说清楚！
你的克隆载体是什么载体？很多克隆载体上都带有酶切位点的，可以直接将你的目的基因切下来，从而避免了再使用引物进行扩增。
5端的碱基去掉几个？那你的基因就不完整了，如果你原来的引物没有酶切位点也没有保护性碱基，你直接加上酶切位点也没有保护性碱基就可以了
为什么要去掉几个碱基呢？3端可以去掉 5端去掉你的基因碱基数量就不对了啊
对于你的试验我很迷惑，你连到克隆载体上的时候，如果克隆载体没有酶切位点，你连上的目的是什么？为什么当时不加酶切位点呢？

[ 本帖最后由 haiwuya 于 08-8-26 09:36 编辑 ]

为什么要切下来，设计个带酶切位点的引物直接去扩增不就好了，只要原来引物的Tm值合适，一般直接加上酶切位点和保护碱基就行了，少数情况会有DIMER或HAIRPIN出现，一般不影响

是这样的，我原来在克隆这段基因的时候，所用的引物没有加酶切位点，只是挑了一段保守区，现在这段基因已经测序了，我该做表达了，我还要重新设计引物，但我原来那对引物的特异性很好，所以我想继续用，我要用pET系列的载体，用NDE1和HIND3酶切位点。但我原来设计那对引物的时候没有考虑起始密码子和终止密码子，上游引物和开放阅读框架的起始密码子之间还有十几个碱基，但又有人说引物应该从起始密码子开始找十几个碱基就好了，下游引物也是找最后的十几个碱基，然后加上终止密码子和酶切位点。我想如果直接用原来的那对引物加上酶切位点的话，会不会发生移码啊？

移不移码看你自己设计，数数就知道对不对，但是一般不推荐连同UTR一起做表达，这样你做出来的结果不能被人承认，因为重组蛋白不仅可能有载体融合蛋白序列存在，还有UTR编码的几个AA，到底是因为什么起的作用你无法证实，如果你要求不高也随便。当然，由于原核是寻找第一个ATG开始翻译，如果是非融合表达，你带上一点UTR也应该没问题
建议重新设计引物，以CDS为目标，加上酶切位点和保护碱基扩增，相关知识还是请看看书。不管你要不要前面那段UTR，你也得重新设计引物，这对没有任何修饰的引物对你做克隆好像没什么意义

好的，明白了， 谢谢回答！

但NDE1含有ATG，我如果根据CDS设计引物的话，我是不是要把目的基因片段上的ATG去掉啊？不然，片段的起始密码子就被翻译成蛋白了。您说呢？还是不管那么多直接从ATG设计啊？

[ 本帖最后由 爱喝绿茶 于 08-8-26 21:45 编辑 ]

非融合表达的话，去掉。融合表达可以不用去