各位大侠，我现在在做表达载体的构建，已经连接好了，要先转化到JM109中再保存质粒，再用质粒去转化Rosetta后做表达。可我现在遇到问题了，在连接后转化JM109就是不出来菌落，或是长了有菌落但做菌落PCR不出来结果。我都郁闷死了。做这个都做了快一个月了。谁能教下我是什么问题啊！谢谢

就这样很难说是什么问题。先给你一个建议，你把PCR产物连到T载体上去测序，看看引物有没有错误，特别是酶切位点
PS：你上面说的好混乱啊，一下是“已经连接好了”，一下又是在连接后转化不成功，那你怎么知道连接好了？

你的基因片段是多大？建议你将PCR产物连接到T上，测序验证一下。
如果正确无误，可以从T载体上切下片段，回收，再和表达载体连接，这样连接的效率个人感觉比PCR产物直接酶切后与表达载连接的效率要高。

这几天一直在弄那个问题！谢谢你们对我的回答！
我的是PCR产物连了T载体后转化JM109的，获得质粒后做了双酶切，回收目的片段后连接PET44载体，连接后再次转化JM109，现在就是在第二次转化JM109时出现问题，一直都得不到阳性的菌落。仔细分析过感受态的问题、质粒的问题、还有转化过程的问题，都没有找出是什么原因。我都快急死了。还等着去做突变改造呢。

原因可能是你的目标片段与pET44连接有问题
所以搞清楚以下几个问题
1.你的片段从T载体上是否很好的切下来了？片段大小可对？切下来的片段纯化后有没有跑胶鉴定一下片段浓度？
2.pET44的酶切是否又问题?切开以后跑胶鉴定大小可对？纯化以后同样需要跑胶看一下浓度。
3.连接方法
4.载体抗性