引用:
原帖由 稳稳飞 于 08-6-10 09:41 发表 
好像时间稍微长了点，不好意思！
附件中是4、5部分的译文。
望各位多多提意见！
呵呵，感谢飞版的大力支持！
飞版的翻译稿：
蛋白表达
大肠杆菌作为重组体的宿主细胞用于初级研究
真核和原核蛋白中具有稳定折叠的球形区域（例如催化区域或者蛋白相互作用区域）是生物医药研究社区和实验室的一个研究焦点。这些蛋白质一般适合在大肠杆菌中表达。这些年来，人们付出更多的努力去优化大肠杆菌作为蛋白表达宿主的最佳条件以得到更多的有机体。这个策略已经产生了一些工具从而增加了更多可溶性蛋白。令人惊讶的各种各样的其他类别的蛋白质，从全长细菌和人类蛋白质到蛋白质复合物，甚至一些人的膜内在蛋白质都可以在大肠杆菌中表达。大规模蛋白表达试验以全长蛋白质的方式分析表明，真细菌或古细菌中50％的蛋白质和真核生物中10％的蛋白质可以在大肠杆菌中以可溶蛋白形式表达（http://targetdb.pdb.org/）。
总体而言，成功表达一个可溶性蛋白（分子量60 kDa以上）蛋白的概率会随着其分子量增大而相应地减少（图1）。蛋白质没有表达成可溶性形式可能就不会被正确修饰或折叠，或可能通过形成包涵体沉淀在大肠杆菌中。值得注意的是，在异源宿主中进行表达并不是唯一说明低成功率的原因；即使经过多方面的表达条件，当蛋白在大肠杆菌中过量表达时，30%的蛋白是不能以可溶形式表达的。
在这些研究基础上，我们认为任何蛋白（无论什么来源）的第一次尝试重组表达总是会选择大肠杆菌作为表达宿主。在一个相对较短的时间内，用大肠杆菌测试多种可能的战略，并完成一个比较全面的分析是一种快速且便宜的方式。替代系统应该在大肠杆菌系统被合理性探讨后使用。这种观点说明：和其他系统（人或昆虫细胞）相比，在大肠杆菌系统中表达一些蛋白（全长真核蛋白，整个膜蛋白）的低概率的事实，和在许多情况下，大肠杆菌系统是有用的，也远远更具有成本效益和方便的事实。
大肠杆菌菌株
为了得到高效蛋白表达的目的，BL21(DE3)是一种适当的大肠杆菌菌株。它的优势在于它缺乏lon 和ompT蛋白酶，并且具有与T7 lacO启动子系统的一致性。对于真核生物蛋白来说，使用具有额外tRNAs的BL21(DE3)衍生物去克服密码偏爱性的影响是很重要的。从历史上看，氨苄青霉素一直是最常用的抗生素筛选标记，但它正在由羧苄青霉素取代，因为它更为稳定。编码抗卡那霉素或氯霉素的载体现在也被广泛使用。
融合组氨酸标签
我们建议蛋白质应该融合一个蛋白标记物进行表达，因为标记物在蛋白质纯化方面有很大的帮助，而且很少对蛋白的生物或生化活性有不利影响。不过，选择哪一个标记物来使用，你就必须面对很多数目的选择。我们的团队摸索过大部分可用的选项，并且我们观察到没有亲和标签可以在成功的生产可溶的，有活性的重组蛋白方面显得更有效。尽管在成功率的基础上缺乏一个很好的标签，我们大部分的研究小组选择了一个N端hexahistidine标签，它可以被一个特异的蛋白酶移除，例如烟草蚀刻病毒蛋白酶。不过，其他许多实例可以发现，一些蛋白质只有融合了其他的亲和标记才可表现为可溶性的形式。
选择N端hexahistidine的原理是多方面的。首先，N末端标记能确保细菌的转录和翻译机器在遇到5'和N端序列分别和强大的RNA合成及蛋白表达相一致。其次，oligohistidine标记的蛋白质可以使用具有较为简单的协议的固定金属亲和层析进行纯化。再次，组氨酸的标签很少影响蛋白质的特点，这是它区别于其他标签，例如，谷胱甘肽转移酶（GST），它本身就是一个二聚体，对重组蛋白而言它会加强二聚体的形成。第四，该hexahistidine标记相对较小，通常不会大幅改变目标蛋白的溶解度性能。相比之下，较大的标记，例如麦芽糖结合蛋白，往往可以明显增加重组蛋白的溶解度，即使当蛋白质是由不溶性的性质，或不稳定或展开，因此，不太可能被活化。第五，对于特定的蛋白质结晶学应用，短的组氨酸标签，似乎是中性的反应物；在我们大部分的项目中，我们经常尝试用结晶和核磁共振结构测定裂开的、未裂开的蛋白质和其中所产生的三维空间结构的相关描述大约相同。最近的PDB性的调查还表明，hexahistidine标签对目标蛋白的N端结构没有一致的影响。
基于T7 RNA 聚合酶的表达载体
最常用的表达载体是pET载体（默克；pET系统说明，2006），它推动了重组基因在T7 RNA聚合酶启动子和lac操纵子的控制下进行表达。载体是为在含有λDE3溶菌素的大肠杆菌使用而设计的，其中隐藏了一个在乳糖抑制子控制下的基因组拷贝基因的T7 RNA 聚合酶。在抑制的条件下，T7 RNA聚合酶不产生，大多数细胞蛋白合成体系会合成目的蛋白。有时，在这些菌中，T7聚合酶的低水平表达会导致重组蛋白的表达，并且可能会减缓或阻止转化细菌的增长。使用T7溶菌酶表达菌株会影响这些高毒性蛋白的表达，而阿拉伯糖启动子通过在无细胞体系中产生蛋白或者更严格的调节阿拉伯糖启动子系统去直接推动重组蛋白的表达来控制着这些具有T7RNA聚合酶的菌株。
表达条件
使用T7系统，可以通过化学诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导或在大肠杆菌中处理碳源（自身诱导）进行蛋白表达。在以上两种情况下，细胞可以，并且应该成长为高密度（OD600为4-20）在高度浓缩的培养基中振荡培养。不管最终的细胞密度怎样，可取的做法是在生长曲线的中期到后期阶段诱导表达的T7RNA聚合酶，以确保最大收益率，同时避免相关的细胞进入平稳阶段的问题（例如，蛋白酶诱导）。T7系统的一个特征是许多重组蛋白在37 ℃表达时会生成沉淀物，而在15-25℃诱导时就会是可溶的，大概是因为减缓蛋白生产，让新转录的重组蛋白有时间去正确折叠。因此，低温诱导应该用来做为选择。
小规模试验的表达
小规模试验的表达被广泛用来作为预测工具以确定哪些克隆子产生可溶性蛋白质，并为大型的增长建立最优参数。主要是重组蛋白的表达水平和溶解性，它们是受培养条件和通气程度所影响的。而这些参数并不随着培养体积的改变而线性改变。小型和大型生长的结果由于用于每个规模的样品制备和蛋白质纯化的方法的不同而不同。
因此，阳性小规模实验往往预测的结果从大型的增长，不可避免会出现很大比例的假阴性，也就是说，在大规模生长时表面上是没有表达或者形成不溶蛋白，而事实上是表达为可溶形式。如果可以检测到的重组子很小（例如，<20重组子），更明智的做法可能是立即着手较大规模的培养，以避免任何潜在的复发变化。
为了分析大量的重组子，我们使用96孔格式的1-20毫升体积的平板平行检测小规模的蛋白质纯化。这种规模通常可以生产10-200 μg蛋白质，足够用于许多分析测试。该结果可用于在大规模纯化之前的构建设计和实验条件的优化。
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本帖最后由 hamye 于 08-6-10 11:16 编辑 ]
