免疫荧光技术

一、一些基本概念和基本知识：

1 荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。
2.技术分类：
  ⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术)
    抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判
    定结果的检测方法。

  ⑵ 免疫荧光测定技术：
    抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定
   荧光强度而推算被测物浓度的检测方法
3.荧光的产生：
       物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。
       这种物质，称为荧光素        
    由光激发所引起的荧光，为光致荧光
                   ------荧光免疫技术     
    由化学反应所引起的荧光，为化学荧光
                   ------化学发光技术
4.荧光素的荧光特性：

⑴ 停止供能，荧光现象随即终止
⑵ 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性
    入射光波长<发射光波长
⑶ 荧光效率：        发射荧光的光量子数
       荧光效率=-------------------------------
                   吸收光的光量子数
  ⑷ 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱
5.常见荧光素：
  
  ⑴ FITC
  ⑵ RB200
  ⑶ TRITC
  ⑷ 镧系：Eu、Tb
  ⑸ PE
  ⑹ 其它
常见荧光素的特性：
  ⑴ FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，
       发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
  ⑵ RB200： 橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光
            595~600nm，橘红色荧光。
  ⑶ TRITC： 紫红色粉末，吸收550nm，发射光            
            620nm，橙红色荧光。
  ⑷ 镧系：Eu、Tb
  ⑸ PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色
          荧光。
  ⑹ 其它：酶作用后产生荧光物质。
酶作用后产生荧光物质：
酶    底物    产物    激发光  发射光
Β-G    MUG    MU     360      450
AP    MUP    MU     360      450
HRP  HPA    二聚体    317     414   
6.合适荧光素的选择
  ⑴ 具有与蛋白质形成共价键的化学基团。
   荧光素-N=C +NH-蛋白质     荧光素-N-C-N-蛋白质
            ‖  ︱                 ︱‖ ︱
            S  H                  H S H
  ⑵ 荧光效率高，标记后下降不明显。
  ⑶ 荧光色泽与背景色泽对比鲜明。
  ⑷ 标记后能保持生物学活性和免疫活性
  ⑸ 标记方法简单、快速。
  ⑹ 安全无毒
二、 荧光抗体的制备
  
  1  荧光素与抗体结合（标记）
  2  荧光抗体的纯化
  3  荧光抗体的鉴定
  
1.荧光素与抗体结合方法：
   ⑴ 透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体
              积小的抗体溶液的标记
           ②标记较均匀，非特异荧光较低
  
   ⑵ 搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品
              体积较大的抗体溶液的标记
           ②标记时间短、效率较高，荧光
              素用量节省
           ③影响因素多，非特异荧光较强
**透析法

第一步：  将含10mg/ml的Ig溶液10ml
          装入透析袋。
第二步：  将上述透析袋放入烧杯中 ：
          含0.1mg/ml FITC的
          pH=9.4的碳酸盐缓冲液100ml。
第三步：  4℃磁力搅拌24h。
第四步：  取出透析袋，进行纯化、鉴定

**搅拌法

第一步：  将含40mg/ml BP 溶液5ml
          装入反应瓶中。
第二步：  加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐
          缓冲液4ml         
  第三步：  25℃磁力搅拌下，逐滴加入
          1ml含2mg的FITC溶液
第四步：  25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌
        4h，然后进行纯化、鉴定
2. 荧光抗体的纯化：
  ⑴ 除去未结合荧光素
  ⑵ 除去标记不适当的抗体
  ⑶ 除去非特异反应物质

  *****
   (1)除去未结合荧光素：
  
  A 透析法：
  将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲 液中，在4℃下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。
  B 凝胶过滤法：
  葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml.
  
   (2)除去标记不适当的抗体：
    采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。
    未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。
    过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。

   (3)除去非特异反应物质：

   将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。
   按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在用50mg/ml比例重复一次。
   
   3. 荧光抗体的鉴定：
   ⑴ 抗体含量测定：双扩法

   ⑵ 结合比率(F/P)测定：
    分光光度法，并按下式计算：
    FITC:  F/P=2.87×A495/(A280-0.35×A495)
    RB和TRITC:    F/P= A515 / A280
    *  F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。
   *  固定标本染色以F/P=1.5左右为宜
   *  活细胞染色以F/P=2.4左右为宜
三.荧光抗体技术：

    ㈠抗原片的制作
    ㈡试验类型
    ㈢荧光显微镜检查
  ㈠抗原片的制作
  1 制作：
   *临床常见的标本有组织、细胞细菌三大类。

   *可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
   *细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗原片。
   2 标本的固定：
   ⑴ 固定目的
   *防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
   *去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
   *易于保存。
   *（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用活细胞染色）。
   ⑵  常用的固定方法：
    抗原        固定剂          固定方法
   蛋白质      95%乙醇        室温3~10min或4℃30min
      Ig类        甲醇             同上
    酶类        丙酮             同上
    激素        CCl4                  同上
    类脂质      10%福尔马林        室温3~10min
      多糖(细菌)      10%福尔马林     室温3~10min或4℃30min
                  丙酮、甲醇
    病毒        无水乙醇      室温5~10min或4℃30~60min
                   丙酮、CCl4         或-20 ℃60min以上

   ㈡试验类型
    1 直接法

2间接法

3补体结合法

三、其它免疫荧光技术
   流式细胞仪
   时间分辨免疫荧光技术
   荧光偏振免疫分析技术
   时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
基本原理是：利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。

   时间分辨荧光测定的特点：
   1 采用脉冲光源(每秒闪烁1000次以上的氙灯),
   照射样品后即暂短熄灭.
    2 以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧
   光衰退后，再测镧系荧光。
   3 镧元素具有较长的荧光寿命(105ns)，延缓测量时
    间，能有效地消除非特异本底荧光(10ns)的干扰，
   4 镧系螯合物的激发光与荧光发射峰之间的波长差
    异(即较大的Stokes位移），有利于排除非特异性
    荧光干扰，提高检测特异性。镧系元素有Eu、Sm
      Tb、Nd 和Dy等，其中以Eu最为常用。
   5 测定技术类型有：竞争法、夹心法、间接法等。
  
   荧光偏振免疫分析技术（fluorescence polarization immunoassay,FPIA）是利用荧光素经单一波长的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小成正比的关系而建立的免疫分析技术；技术类型主要采用竞争法。

  免疫沉淀
免疫沉淀的成功依赖于抗原的纯度以及制备抗原的难易，主要受两方面因素的影响：1抗原原液的丰度 2 抗体对抗原的亲和力。
有3种类型的抗体可用于免疫沉淀：多克隆抗体，混合单克隆抗体和单克隆抗体。
      多克隆抗体      混合单克隆抗体      单克隆抗体
反应强度      极好      抗体依赖性（极差到极好）      极好
特异性      一般良好（有时本底高）      极好，但有些出现交叉反应      极好，避免使用有交叉反应的抗体
优点      稳定，多价反应      特异，供应不受限制      稳定，多价反应。特异，供应不受限制
缺点      本底不易清除      需对抗原有高亲和力      供应不普遍

多抗的本底较高，可通过滴定产生免疫沉淀所需的抗血清量，来有效地清除某些非特异性本底。其方法是将特异性抗体降低到能定量结合抗原的最低滴度，使本底保持最低。
免疫沉淀要求抗原的纯度尽可能提高。降低本底，用不与待检抗原结合的非特异性抗体预处理，可以从抗原溶液中除去非特异性结合蛋白，即此法第一次是用非免疫抗体降低本底，第二次再用所研究的抗体，这样进行二次免疫沉淀是达到纯化免疫沉淀物最有效的方法。
裂解细胞
防止释放到裂解液里的蛋白酶其消化作用影响免疫沉淀，可采用两种方法减弱其作用。首先，必须保持标本冷却，因温度可影响大多数蛋白酶的降解速度。其次，可在溶解缓冲液内加入蛋白酶抑制剂。Aporotinin和本甲基磺酰氟化物（PMSF）最常用。最好是集中蛋白酶抑制剂混合使用，特别是作为进一步实验的起点时，这样有助于确定该抗原的最佳抑制剂。
蛋白酶抑制剂      工作浓度
Aporotinin      1  μg/mL
亮氨酸      1  μg/mL
胃酶抑素      1  μg/mL
PMSF      50 μg/mL
终止蛋白酶作用的最好方法时在免疫沉淀的全部过程中溶液保持低温。
1准备工作
免疫沉淀有多个步骤，包裹数小时孵育，一次在实验前必须安排好时间，注意适当利用过夜孵育的时间间隔。这将有助于决定何时开始裂解细胞。
2所需溶液
PBS，裂解缓冲液（4℃预冷）
3操作步骤
（1）      单层细胞的培养，用室温PBS洗细胞一次，然后甩干；悬浮培养的细胞，以400g离心10min，收集细胞弃上清液。
（2）      对于单层细胞培养，将培养瓶置于冰上，没100mm培养瓶加入1mL溶解缓冲液（4℃预冷）；对于悬浮培养，将盛细胞团的试管置于冰上。按107个细胞加入1.0mL裂解液（4℃预冷）
（3）      冰上放置3min，不时敲击贴壁细胞培养瓶，或轻摇悬浮培养细胞。
（4）      对于单层细胞培养，敲击培养瓶数次，混合均匀，在冰床上倾斜培养瓶使溶液集中于一侧，然后将裂解物移置另一支1.5mL圆锥形试管。
（5）      单层培养的细胞或悬浮培养的细胞均以10 000g，4℃离心10min，仔细吸取上清液盛于另一试管，不可搅动细胞团。置冰上。
此时，上清液可用于下一步的预处理。
4常见问题
最普遍的问题使抗原不完全从细胞内释放。可以通过对裂解液和细胞残渣进行免疫印迹来检查抗原是否完全释放。
改变裂解液所用的去污剂使增加抗原释放的最有效方法。
机械性剪切也可破坏细胞膜，常见的方法包括超声波发生器、Dounce匀浆器、波特和搅拌器等。最温和的方法是Dounce匀浆器，但仅适合较大体积的标本（数毫升或更多）
一般不推荐冻融法，会使蛋白质过量降解，原因不明。

三 裂解物的预处理
      降低本底和改进信噪比的最有效方法是去除裂解物中的某些无关蛋白，因其在完成免疫沉淀的最后步骤之前能与免疫复合物或固相的载体非特异结合。这在清洗一步完成。
      将裂解物通过一系列模拟免疫沉淀的步骤。将不能识别靶抗原的抗体加入裂解物内，如同正常免疫沉淀进行操作。其目的是首先用无关抗体去除所有可能污染免疫沉淀最后步骤的非特异蛋白。
      推荐使用从未经过免疫的健康家兔的血清，可以提供不同抗体的混合物，即不限于针对特定的免疫应答。同时推荐使用经过固定的金黄色葡萄球菌COWANI株（SAC）作为蛋白A的来源以收集兔抗体。
      在预处理的早期阶段加入血清，也有许多优点。因为血清含有许多强有力的蛋白酶抑制剂，并可作为稳定缓冲液发挥可溶性因子作用的蛋白来源，这些特性是细胞裂解物中其他蛋白无法代替的。
      预处理步骤的唯一不足就是费时，但在多数情况下其优点远远超过缺点。如果最后检测步骤是免疫印迹，则不必进行预处理。
1准备工作
为方便使用，推荐预先制备10％SAC混悬液，1mL分装，－20℃保存
2 所需溶液和试剂
含10％正常家兔血清的裂解缓冲液。
3操作步骤
（1）      每1mL样品（溶解物或抗原溶液）加50μl正常兔血清
（2）      冰上孵育1h。
（3）      在进行孵育的同时洗涤压积的固定SAC（最好是数家公司够得）10 000g离心30s，弃去上清液，然后将SAC悬浮于裂解缓冲液，用毛细吸管搅拌，10 000g再次离心，完全弃去洗液。将洗涤后的压积SAC团置冰上。
（4）      1h孵育后，用裂解物混悬洗涤过的SAC，再次搅拌
（5）      将糊状的SAC/裂解物在冰上孵育30min，不必混匀，因为SAC的浓度较高而且在固定的SAC表面有大量的蛋白A分子。
（6）      10 000g离心15min，仔细吸出上清液移置至另一试管，小心不要混入SAC，必要时可重复离心。
此时，样本即可入加抗体进行下一步试验。
4常见问题
预处理是使用的非特异抗体应定量移去，以免其在免疫沉淀中竞争结合。任何抗体都可用于预处理，但最好是和蛋白A有高亲和力的抗体。为此我们推荐使用兔血清，因其容易获得，而且能牢固地定量结合于金黄色葡萄球菌蛋白A。此外，使用固定的SAC比蛋白A微珠更容易结合兔抗体。
若担心预处理的兔抗体不能完全去除，可使用新鲜的裂解缓冲液代替裂解物。在开始进行预处理的第一步加入50μl正常兔血清，其他步骤同上。但在步骤（6）时将上清液移至另一试管，然后完成余下的免疫沉淀步骤。最好将免疫沉淀蛋白进行SDS－PAGE电泳、考马斯亮蓝染色。若样本中出现重链和轻链条带，即表明兔血清抗体没有完全去除。可以增加SAC的浓度，彻底去除用于预处理的非特异性抗体。

四，免疫复合物的纯化
1抗体的用量
无需为此花费大量时间。如果需要鉴定某一抗原，建议使用1μL血清，50μL杂交瘤细胞培养上清液，或0.5μL小鼠的腹水单抗。对于大多数高亲和力的抗体来说，这足以使大部分的抗原发生免疫沉淀，而且抗体的水平很低，不需要考虑凝胶本底偏高或免疫球蛋白的重链邻近部位发生变形等诸多问题。
     在需要进行定量测定及要求将本底保持很低时，所加抗体的量应该通过滴定来确定，其用量取决于抗原的含量、抗体与抗原的亲和力和发生免疫沉淀时的容积。抗体的准确用量可通过与恒定量的抗原进行滴定。一般开始时的滴定范围在0.05~5μL的多克隆抗血清，1~100μL杂交瘤细胞培养上清，0.01~1μL的腹水之间。对应于这三个范围中位值的重链数量大约为1μg。此量足够通过SDS－PAGE经考马斯亮蓝染色很容易地检测出重链。染色条带的存在可以消除疑虑，因其表明抗体能与蛋白A或蛋白G微球有效的结合。
滴定抗体量的另一个好处是有助于降低非特异性本底。
2免疫沉淀的体积
终体积决定抗体与抗原结合达到平衡状态的速率，小量比大量更快达到平衡。但是容积越小，对非特异反应亲和力的促进就越大。所以使用大容积可有效地降低本底，同时，加入蛋白A或蛋白G微球后的混匀也很重要，较大的容积有利于微球与抗原/抗体溶液的良好混匀。综合考虑上述多种因素，一般认为在1.5mL的圆锥管中，终容积接近于0.5~0.75mL较好。通常情况下，免疫沉淀中所选用的大多数抗体于抗原有较高的亲和力，这就使得反应的体积不那么重要了。此外，对大部分研究者来讲，解决本底问题要比希望获得100％的抗原更为重要。加入裂解缓冲液可以增加终容积，如果需要，可以用1％的牛血清白蛋白减少非特异蛋白的结合。
      在本底不存在问题的情况下，如希望得到溶液中所有抗原，容积应尽可能小，这样有助于抗原/抗体反应完全。
     最后一点，有时要考虑所有抗体的类型。应用多克隆抗体时，很少考虑反应的体积。因其亲和力通常较高，能与抗原有效结合，即使是使用稀释的抗体也能从溶液中分离得到相应的抗原。应用高亲和力的单克隆抗体，也可能得到相似的结果。然而，应用低亲和力、高浓度的单克隆抗体是，小体积有助于反应完全。
3蛋白A与蛋白G的比较
纯化免疫复合物的所有方法都需要能与抗体结合的第二试剂，通过与第二试剂结合可将抗体从溶液中分离。在整个纯化过程中，抗原仍与抗体结合。最早的方法是应用抗免疫球蛋白的抗体（抗抗体）以形成大的抗体－抗抗体复合物，这种多分子的复合物被称为晶格结构。当晶格结构大小适当是，离心即可分离。离心仍是纯化免疫沉淀的最好方法之一。然而，形成足够大可以离心分离的复合物主要取决于抗免疫球蛋白的抗体与第一抗体（一抗）的克分子比。为了定量地获得免疫复合物，对所用的每种一抗都需凭经验测定其与抗抗体的合适比例。在某种程度上，晶格结构的大小也取决于抗原的含量和类型。大量的多决定簇的抗原和少量的单一决定簇抗原比较，前者可以改变晶格的大小。单抗不利于形成晶格结构。
为了解决这些问题，Kessler建议使用富含蛋白A的金黄色葡萄球菌Cowan1（SAC）作为吸附抗原－抗体复合物的固相载体。蛋白A是细菌细胞壁的组成成分。用甲醛固定胞壁蛋白和加热处理杀死细菌，即成为能与抗体结合的固相载体。蛋白A与抗体的Fc段结合，因此，不会影响抗体与抗原的结合。
近些年来，广泛使用重组的蛋白A和蛋白G取代SAC，并将其与多种不同的微球载体共价结合。使用这种固相物还可减少使用SAC时遇到的某些本底问题。选择蛋白A还是蛋白G微球取决于抗体与这两种蛋白的亲和力。
4对照
多克隆血清应与来自于相同种属的其他多克隆血清比较，最好是用同一动物在免疫前所采集的血清做对照。单克隆抗体的对照必须与特异性抗体的来源相同，即细胞培养上清液对比上清液，小鼠腹水对比腹水或纯化抗体对比纯化抗体。如有可能，对照抗体应该与特异性抗体同属于一类或同一亚类。来自于母系骨髓瘤的细胞培养上清液不适合做对照，以为其中不含抗体。合适的对照杂交瘤细胞系可以从美国典型培养收藏中心（ATCC）或欧洲动物细胞培养收藏中心获得。

对于大多数实验而言，推荐使用1～2μg抗体，这对于少量和中等量的蛋白足以在考马斯亮蓝染色时，显示重链和轻链条带。1～2μg抗体也是一个标准起始量，而且蛋白A或蛋白G微球已调整到能够去除这些抗体的量。
5准备工作
蛋白A或蛋白G微珠混悬液可在用前准备，4℃保存于含叠氮钠的溶液中。
6所需溶液和特殊设备
裂解缓冲液、抗体、蛋白A或蛋白G微球（用含0.02%叠氮钠裂解缓冲液配成10%（V/V）的混悬液，4℃保存）、不含DTT的Laemmli样品缓冲液（2%SDS、10%甘油、60mmol/L Tris，pH6.8和0.02%溴酚蓝）、1mol/L DTT（保存于－20℃）
摇床、抽吸装置
7操作步骤
（1）      将小量裂解物样本分别置于适当数量的1.5mL EP管中，加入裂解缓冲液，至终体积接近0.5mL。加入抗血清（1μL）、杂交瘤细胞培养上清液（50μL）或小鼠腹水（0.5μL）作为抗体的起始用量。滴定时抗血清用0.5~5μL，杂交瘤细胞培养上清液用10~100μL，腹水用0.1~1.0μL。
（2）      冰上孵育1h。高亲和力的结合反应在1h内完成。因而，1h的孵育时间可使大部分的抗体完成反应。
（3）      在抗体－抗原反应液中加入100μL蛋白A或蛋白G微球（用裂解缓冲液配制成10%混悬液），4℃摇动孵育1h（过夜并无好处，还会增加背景）。

在每一步操作的最后，尽可能完全去除洗涤缓冲液，有利于降低背景。
（4）      以10 000g，4℃离心15s，收集微球。用裂解缓冲液清洗免疫复合物3次。裂解产物和洗涤缓冲液很容易通过抽吸法除去。
（5）      尽可能完全吸去最后一次的洗涤液，将免疫复合物用于相应的实验。

用于SDS－PAGE时，加入50μL Laemmli样品缓冲液（2%SDS、10%甘油、60mmol/L Tris，pH6.8和0.02%溴酚蓝），加热至85℃10min，离心，取上清液，将其作为样品加入凝胶内进行电泳。若暂不进行凝胶电泳，可将样本置于－20℃保存。
8常见问题
用什么方法来减少免疫沉淀时混杂在免疫复合物中无关蛋白。本底的产生有多方面的原因，可以是特异性的或非特异性的。在抗体制品中存在的无关抗体可以直接与抗原发生交叉反应而产生特异性背景条带。解决此问题只有两种方法。首先，通过抗原亲和层析柱对抗原特异性抗体进行纯化可除去污染的抗体；其次，加入饱和量的冷蛋白与污染抗体结合而封闭其活性。
非特异本底蛋白有多种来源。他们可以和免疫复合物或蛋白A/G微球形成非共价结合的条带，或与制剂中的特殊物质结合。某些污染蛋白凝聚或聚合成较大的分子可通过离心除去。有些蛋白质可被抗原－抗体蛋白A/G复合物的晶格结构网获。污染的蛋白亦可与用于离心免疫复合物的塑料管结合。

推荐使用以下方法解决非特异本底问题：
①加入饱和量的竞争蛋白。常用的有BSA，明胶，丙酮脏器干粉或5%的脱脂奶粉。将SAC或蛋白A微球储存在含2%BSA的缓冲液中。
②在加入抗体之前100 000g，30min离心裂解产物，除去凝聚的蛋白质。
③试用不同的抗体。
④将抗体在100 000g，30min离心，重新滴定。
⑤使用较强烈的洗液，可试用1.0mol/L氯化钠、0.5mol/L氯化锂、1mol/L硫氰酸钾、0.2%SDS或1%Tween20.改用浓度由高到低的缓冲洗涤液或不同的去污剂也有帮助，亦可试用蒸馏水洗1次。
⑥增加清洗次数，每次清洗时使固相载体在洗液内留置10min
⑦若检测放射活性，将cpm值减少到抗原检测所需的最低限度。
⑧在使用之前，裂解物不可冷冻。
⑨如果特异性的蛋白仍然存在，则待检蛋白可能包含多条多肽链。



050330
免疫共沉淀步骤：
1  100μL（3×104）细胞裂解液上清加富集抗体Anti－A19/Anti－Era，5μL。
4℃ 1.5hrs，不时振摇，使抗体与蛋白结合。（理论8×105 cells ，1-5μg抗体，多抗约1-2μL，单抗约0.5μL）
2  加入100μL PAS（10%），4℃1.5hrs，持续振摇，保持PAS处于悬浮状态，但不宜剧烈。到时间观察PAS是否沉淀在管底，如果是在调整振摇的状态使之悬浮，继续0.5hr。
3   轻微离心5-10s，除去上清，不要吸干净，防止PAS的损失。
4   加500μL 4℃预冷的RAPI裂解液（不加PMSF），温和重悬，4℃离心10 000rpm×15s。重复洗三次。
5   加500μL 50mM HEPES pH7.5 重悬PAS，再离心（同上），尽可能除去上清，此步是为了在SDSPAGE中避免gel artfacts。
6   加25μL 2×LoadingBuffer （bait 20-30KD  target 50-60KD用非还原loadingBuffer 否则用还原loading Buffer）100℃ 煮沸5min，室温离心14 000rpm×5min。
7    转移上清至一新EP管，注意避免吸上沉淀（PAS），－20℃保存，使用前100℃煮沸。

上清的预清除（除去上清中与PAS结合的蛋白）
1 稀释上清（8×105cell）至300μL，加入100μL PAS
2 4℃温和振荡1hr，保持PAS悬浮，但防止产生泡沫
3 4℃离心14 000rpm×1min
4 将上清转移到新EP管中，尽量不要吸入PAS。

上清的预清除（除去干扰后续反应的杂蛋白）
上清加入未免疫的兔血清模拟免疫沉淀步骤，将除去所有可能污染免疫沉淀最后步骤的蛋白。

PAS的预清除
100μL的proteinA 加800μL预冷的裂解液，10 000rpm×30s，去除上清，用800μL 裂解液洗一遍，重悬于100μL 裂解液。

我的细胞100μL/管，约3×104，共三管。

  免疫细胞化学技术
一、免疫细胞化学技术的概述
¨   免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)
–   是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为～。
(一) 对抗原和抗体的要求
¨   具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
–   对抗体的要求：纯度高、比活性强；
¨   高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
–   对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。
(二) 抗原 (antigen, Ag)
¨   抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：
–   免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；
–   免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
¨   根据抗原是否显示免疫原性分为：
–   完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。
•   免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
–   半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
•   半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载 体
¨   通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给偶联的半抗原能力。
–   常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
–   用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体 (antibody, Ab)
1、抗体的概念：
¨   机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。
–   抗体主要存在于血清内；
–   抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
–   免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。

2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。
¨   单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
–   特异性强、抗体产量高。
¨   多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
–   特异性低，会产生抗体的交叉反应。
–   多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
–   抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
¨   动物的选择
¨   佐剂(adjuvant)
¨   免疫方法
¨   免疫剂量
¨   抗体效价的测定
¨   放血或定期抽血
(1) 动物的选择
选择什么动物来免疫取决于：
¨   所需抗血清的量
–   小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。
¨   能供免疫用的抗原量
–   小鼠50mg足够，而山羊需要几毫克。
(1) 动物的选择(续)
¨   动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
–   例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
–   常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。
(2) 佐剂 (adjuvant)
¨   一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。
¨   最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:
–   弗氏不完全佐剂(Freund&#39;s incomplete adjuvant)
–   弗氏完全佐剂(Freund&#39;s complete adjuvant)
弗氏不完全佐剂
(Freund&#39;s incomplete adjuvant, FIA)
¨   是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
¨   使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂 (Freund&#39;s complete adjuvant, FCA)
¨   在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2～20mg/ml)，即成为FCA。
¨   免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。
–   一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法
¨   研磨法：适于制备大量的佐剂抗原
–   先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。
–   按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
¨   缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
¨   注射器混合法
–   将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
¨   优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。
¨   缺点：不易乳化，时间长。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
¨   快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
–   将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。
–   每次乳化 10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。
¨   优点：简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定
¨   判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。
(3) 免疫方法——免疫途径
¨   常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
¨   一般采用多点注射方法
–   常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
–   皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。
(3) 免疫方法——免疫途径 (续)
¨   几点说明：
–   大动物一般不用腹腔注射
–   颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射
–   抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100mg抗原即可获得较好的免疫效果。
–   皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。
(3) 免疫方法——次数及间隔时间
¨   次数一般为2～3次(初次免疫和加强免疫)
–   首次注射后，10～15天再加强注射；
–   剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。
¨   间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长
–   豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；
–   第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。
举例1：家兔的免疫
¨   初次免疫
–   用50～200mg Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；
¨   两周后，加强免疫
–   将50～200mg Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；
¨   抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血
–   抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。
举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔
¨   一般选择2.5～3.0kg的新西兰种公兔
–   先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；
–   10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；
–   以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25～50mg；
–   末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。
举例3：豚鼠和大鼠的免疫
¨   初次免疫
–   用10～100mg Ag加入FCA，在背部皮内注射4～6点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射；
¨   加强免疫
–   每隔 7～8天，将10～50mg Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；
¨   抗体效价的检测
(4) 免疫剂量
¨   抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；
¨   免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。
(4) 免疫剂量 (续)
¨   各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量
(5) 抗体效价的检测
多采免疫双向扩散法
【基本原理】
¨   指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。
–   将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
¨   优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。
免疫双向扩散法的操作步骤
¨   将玻璃板用水洗净后用75％乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。
¨   将l ％ agar 融化后，置56°C水浴。
¨   在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔(直径 3rnm)，孔间距10mm。
¨   中心孔加5ml 抗原样品，周围孔内每孔加5ml 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。
¨   凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。
¨   观察结果。
抗体效价检测的其它方法
¨   环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；
¨   对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；
¨   酶联免疫吸附试验 (ELISA)。
(6) 放血或定期抽血
常用以下3种方法
¨   颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。
¨   心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。
¨   静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。
(6) 放血或定期抽血 (续)
¨   采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血
¨   血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；
¨   加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。
二、组织和细胞标本的制备
¨   标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件
¨   免疫组化对组织和细胞标本的要求
–   保持所检标本原有的结构、形态；
–   在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。
¨   免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。
–   各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。
免疫组化中常用的组织和细胞标本
¨   组织标本
–   石蜡切片
–   冰冻切片
¨   细胞标本
–   组织印片
–   细胞培养片(细胞爬片)
–   细胞涂片
(一) 石蜡切片
¨   石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法
–   最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；
–   石蜡块还能长期存档，供回顾研究。
¨   石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。
1、取材的特殊要求及注意事项
¨   标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。
¨   取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。
–   细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。
1、取材的特殊要求及注意事项(续)
¨   避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃；
–   镊取组织动作要轻；
–   经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。
2、固定及常用的固定液
¨   取材后的组织需立刻投于固定剂中
–   固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；
–   对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。
¨   常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。
–   醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）
–   醇类（常用乙醇）
–   其它 （丙酮）
(1) 醛类
¨   甲醛(福尔马林)应用最广
–   原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。
–   优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。
–   缺点：
•   甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；
•   醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；
•   分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
–   注意事项：
•   缩短固定时间，降低固定温度(4°C)，为此组织块不宜过厚。
•   改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。
•   固定后充分水洗以减少分子间交联。
•   切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。

¨   戊二醛：
–   穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。
¨   多聚甲醛(常用4%)：
–   可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。
•   主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。
(2) 醇类
¨    最常用的醇类固定剂是乙醇。
–   其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。
–   优点：穿透性强、抗原性保存好。
–   缺点：
•   脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。
•   乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。
(3) 其它固定剂
¨   丙酮：
–   对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少  用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。
3、抗原修复——原因
¨   常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：
–   抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；
–   蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
¨   要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

免疫组化  免疫组织化学的概念：
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？
石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？
根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。
多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） 　

Cat.No.: SGP8920 　　　　　　Size: 10ml
Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃
　　　　Thimerosal, 0.01%, added as preservative
多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。
适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。
[使用说明]
免疫学
操作步骤（可直接在玻片上涂布）
1． 灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。
2． 用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26℃
3． 将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。
4．在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。
[注意]
1． 每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张， 超过90张片子将影响其黏合力。
2． 用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。
4． 释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。
5． 用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。
[订货信息]
　　￥100 / 10ml
免疫组化操作规程      
（一）、仪器设备
   1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；
    2）水浴锅
（二）、试剂
   1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
   2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
   3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA•2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
   4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
   5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
   6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
   7）封裱剂：
    a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；
   b、油和TBS(或PBS)配制。  
   8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
（三）、操作流程
   1、脱蜡和水化
   脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
   1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
   2）无水乙醇中浸泡5分钟；
   3）95%乙醇中浸泡5分钟；
   4）70%乙醇中浸泡5分钟；
   2、抗原修复
  用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
  1）抗原热修复
  （1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
  （2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
  （3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。是以高温，高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120℃高温或强碱处理后，可使交联打开。
  2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
   3、免疫组织化学染色
   SP法
   1）脱蜡、水化；
   2）PBS洗2～3次各5分钟；
   3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
   4）PBS洗2～3次各5分钟；
   5）抗原修复；
   6）PBS洗2～3次各5分钟；
   7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
   8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
   9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
   10）PBS洗3次各5分钟；
   11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
   12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
   13）PBS洗3次各5分钟；
   14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
   15）PBS或自来水冲洗10分钟；
   16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
   17）自来水冲洗10～15分钟；
   18）脱水、透明、封片、镜检。
   SABC法
   1)脱蜡、水化。
   2)PBS洗两次各5分钟。
   3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
   4)抗原修复。
   5)PBS洗5分钟。
   6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
   7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
   8)PBS洗三次每次2分钟。
   9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。
   10)PBC洗3次每次2分钟。
   11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
   12)PBS洗4次每次5分钟。
   13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
   14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
   15)脱水、透明、封片、镜检。

免疫组化实验过程中的要点和技巧
1．      固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存
6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭
10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。
12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
DAB法 显示过氧化物酶
〔原理〕  过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生：AH2（供氢体）+H2O2→A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验可知，有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。

免疫组化染色步骤（以ABC法为例）
溶液的配置：
1. 0.1M PBS 2000ml：NaCL 18g, NaH2PO4•2H2O 0.8g, Na2HPO4•12H2O 12g. 共六份
2. 柠檬酸盐缓冲液：
贮存液：0.1M柠檬酸溶液（A）：21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水
      0.1M柠檬酸三钠溶液（B）：29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水
工作液：9ml A液+41ml B液+450ml 蒸馏水→0.01M柠檬酸盐缓冲液
3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 纯甲醇→充分混匀
4. 20% 甘油：80ml 纯甘油 + 320ml 蒸馏水
5. 稀释抗体：1︰300 ，1︰400 ，1︰600 （临用前配）
6. 酒精的配置
染色步骤：一步法
1. 载玻片 烤箱中 60℃ 40′。
2. 二甲苯Ⅰ，60℃ 20′(水浴箱中)，二甲苯Ⅱ，室温 15′。
3. 脱水，100%→95%→85%→75%酒精，每级均为3′。
4. 蒸馏水冲洗，PBS 5′﹡1
5. 微波炉修复抗原：0.01M 柠檬酸盐缓冲液，99℃ 肺 20′，心肾 12′
6. PBS 3′*3
7. 0.03% H2O2-甲醇，室温20′
8. PBS冲洗，PBS 3′*3，甩干或纸巾吸去多余液体（勿碰到组织），PAP Pen划境线。
9. block solution 封闭抗原，室温10′。
10. 倾出封闭液，不洗，滴加一抗（60ul），4℃过夜或37℃ 1～2h。
11. PBS冲洗，3′*3。
12. 除去PBS，滴加A增强剂，室温25′。
13. PBS冲洗，3′*3。
14. 除去PBS，滴加B剂，室温35′。
15. PBS冲洗，3′*3。同时配置DAB显色剂。
16. 除去PBS，DAB显色10′（在显微镜下观察染色程度控制染色时间）。蒸馏水冲洗。
17. 复染：苏目素均匀滴加2滴，40′′，蒸馏水冲洗，60℃温水泡半分钟。
18. 脱水：75%酒精→85%→95%→100%（3次），每级3′。
19. 透明：二甲苯Ⅰ3′，二甲苯Ⅱ3′。
18. 封片：中性树脂，加盖玻片（组织部位切勿残留小气泡），60℃ 0.5h烘干。
结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。

拍照
1. 更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。
2. 数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉
3. 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。

酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理  基本原理

　　1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 　

方法类型和操作步骤

　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 　

　（一）双抗体夹心法

　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：


　　（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

　　（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

　　（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

　　（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

　　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

　　（二）双位点一步法

　　在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。


　　在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

　　（三）间接法测抗体

　　间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：

　　（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

　　（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

　　（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。

　　（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

　　本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

　　（四）竞争法

　　竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：

　　（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。

　　（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 　　（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。


　　（五）捕获法测IgM抗体

　　血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：


　　（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

　　（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

　　（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。

　　（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。

　　（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

　　（六）应用亲和素和生物素的ELISA

　　亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。

　　亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。


ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色.