RT-PCR
组织和细胞RNA的制备
一、 组织和细胞总RNA提取：
异硫氰酸胍法
（一）试剂准备
1．CSB缓冲液：42mM柠檬酸钠；0.83% N-lauryl sarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸钠)；0.2 mM β-巯基乙醇。
2．变性液：异硫氰酸胍（终浓度 4 M）25g、CSB缓冲液 33ml，混合直至完全溶解，可在65℃助溶。4℃保存备用。
3．2 M乙酸钠：pH 4.0。
4．异丙醇
5．无水乙醇、70%乙醇
6．酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
7．DEPC H2O：100ml ddH2O中，加入DEPC 0.1ml，弃分振荡，37℃孵育过夜。15磅高压灭茵，4℃保存备用。
（二）操作步骤
1．样品处理：
（１）培养细胞：收集细胞1-2×107，离心，500g×5min。对于贴壁培养细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重悬细胞并转移至10ml离心管中；悬浮培养细胞可直接转移离心管；离心：500g×5min；PBS洗涤2次。弃上清，置冰浴。加预冷变性液2 ml，充分摇动，使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。
（２）组织：取1-2g组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置组织匀浆器中，加入预冷的变性液12ml，在冰浴中充分匀浆。
2．加2 M乙酸钠(pH 4.0)0.2ml，混合后将溶液转移至5ml离心管中。
3．加酚：氯仿：异戊醇2.2ml，颠倒混合用力振荡10s，冰上放置10min。
4．4℃离心，12000g×20min。
5．小心吸取上层含有RNA的水相，并转移至一新的5ml离心管中。避免吸取两相之间的蛋白物质。
6．加等体积的异丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA。
7．4℃离心，12000g×15min。
8．弃上清，再加变性液2ml重悬RNA沉淀物，振荡直至RNA完全溶解（必要时可65℃水浴促溶）。
9. 加入等体积异丙醇，置-20℃ 30min。
10. 4℃离心，12000g×15min。
11. 弃上清，加入70%乙醇4ml洗涤RNA沉淀。4℃离心，8000g×5min。
12. 弃上清，将沉淀晾干。
13. 加入适量DEPC H2O溶液解RNA（65℃促溶10-15min）。
（三）注意事项：
1．所有实验过程均须避免Rnase的污染。
2．要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。
TRIzol法
TRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCO BRL公司推出专供提取RNA的产品，其操作方便、快捷。
（一）试剂准备
1． TRIzol试剂。
2．氯仿
3．异丙醇
4．75%乙醇（DEPC H2O配制）
5．DEPC H2O
（二）操作步骤
1． 样品处理：
（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。
（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。
2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。
3．4℃离心，12000g×15min，取上清。
4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。
6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。
7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。
（三）注意事项
1． 样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。
2． 实验过程必须严格防止RNsae的污染。
二、总RNA定量
RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：
RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000
RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。
